(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210512396.2 (22)申请日 2022.05.12 (66)本国优先权数据 20221010480 0.2 2022.01.28 CN (71)申请人 国科温州研究院 （温州生物材 料与 工程研究所） 地址 325000 浙江省温州市龙湾区永中街 道金联路1号 (72)发明人 杨薇　罗春雄　吴蓥男　 (74)专利代理 机构 大连星海专利事务所有限公 司 21208 专利代理师 杨翠翠 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 氧气浓度梯度微环境的构建方法及其应用 (57)摘要 氧气浓度梯度微环 境的构建方法及其应用， 其属于荧光检测仪器的技术领域。 该方法利用微 流控芯片中微米级的腔室通道构建氧气分压微 环境， 装置体积小、 成本低、 气体平衡用量少、 浓 度梯度构建时间短， 能够避免空气中氧气分压的 干扰， 而且 可以同时构建两种及以上的氧气微环 境， 适用于多种氧气分压环境的并行调控及测 试。 该体系气体浓度梯度稳定， 测试通道形式灵 活多变， 应用范围广泛。 比如， 可以对测试区域进 行稳定的氧气分压调控； 可以对 溶液中氧气敏 感 探针的响应 响应曲线进行快速检测； 由于装置底 部为透明玻璃片， 能够配合常规荧光成像/荧光 寿命成像仪器， 还可 以进行活细胞实验， 用于定 量分析活细胞在氧气浓度梯度分压环境中对氧 气浓度的响应情况。 权利要求书1页 说明书7页 附图12页 CN 114894761 A 2022.08.12 CN 114894761 A 1.氧气浓度梯度微环境的构建方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.打开高氧 阀(3)， 高氧分压 的混合气体从高氧气瓶(1)经高氧表(2)后， 由高氧入口 (9d)进入到微芯片(9)的高氧通道(9c)； 然后高氧分压的混合气体从高氧出口(9e)经高氧 出气管(13)排至集气瓶(12)； S2.同时打开低氧 阀(8)， 低氧分压 的混合气体从低氧气瓶(6)输出， 经低氧表(7)后由 低氧入口(9g)进入到微芯片(9)的低氧通道(9f)； 然后低氧分压的混合气体由低氧出口 (9h)经低氧 出气管(14)排至集气瓶(12)； S3.维持20 ‑40min后， 高氧通道(9c)与低氧通道(9f)之间形成氧气分压差； 芯片(9)中 PVDC膜隔绝大气 干扰， 被测通道的氧气分压差由高氧通道(9c)与低氧通道(9f)中氧气浓度 进行调控。 2.根据权利要求1所述的氧气浓度梯度微环境的构建方法， 其特征在于： 在高氧通道 (9c)与低氧通道(9f)之间均布主通道： 主通道之间形成梯度变化的氧气环境。 3.根据权利要求1所述的氧气浓度梯度微环境的构建方法， 其特征在于： 在高氧通道 (9c)与低氧通道(9f)之间按列均布测试腔室， 不同列的测试腔室之间形成梯度变化的氧气 环境。 4.根据权利要求1所述的氧气浓度梯度微环境的检测应用， 包括以下步骤： S1.试样的配制及注入 对荧光染料溶液的荧光测试： 使用对氧气有荧光响应信号的荧光染料， 将其在溶剂中 稀释后， 通入芯片主通道； 对活细胞中的荧光测试： 将待测细胞种在芯片主通道中， 在37℃细胞培养箱中培养， 细 胞贴壁； 使用对氧气有荧光响应信号的荧光染料在细胞培养液中稀释， 在37℃细胞培养箱 中孵育活细胞进行染色， 将细胞外多余 荧光染料替换为无背景荧 光的细胞培 养液； S2.构建氧气环境： 采用氧气浓度梯度微环境的构建方法， 使高氧通道(9c)与低氧通道 (9f)之间形成氧气分压 差， 在不同的被测通道上构建出不同的氧气环境； S3.荧光信息的采集 启动高分辨荧光检测仪， 并根据试样中荧光染料进行激发波长的选择， 检测器前放置 长通/带通滤光片； 采集试样的发光寿命或荧 光强度。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114894761 A 2氧气浓度梯度微环境的构建 方法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一种氧气浓度梯度微环境的构建方法及其应用， 其属于荧光检测仪器 的技术领域。 背景技术 [0002]氧气是最常见的气体之一， 许多化学反应以及细胞的生理活动都与氧气浓度息息 相关， 生物组织及细胞内的氧气含量通常反映相应的生理状态， 特别是一些疾病在发展初 期， 会导致相应的生理微环境氧气浓度的改变。 因此， 对氧气微环境进行精确的调控及检 测， 对科学研究、 环境 监测、 健康卫 生及癌症诊疗等方面都具有重要意 义。 [0003]传统的构建氧气分压的方法主要为使用气瓶在溶液中鼓气， 其缺点是气体平衡时 间长、 消耗气体多、 每次平衡只能获得氧气浓度环境， 如需构建多种 氧气环境， 还需要准备 数量众多的气瓶， 十 分不便， 而且该方法难以应用于构建活细胞的氧气测试微环境， 也无法 与传统成像系统相配合， 实时调控和检测活细胞内部的氧气分压。 目前， 缺少一种高效的方 法， 能够准确构建氧气分压微环境， 不仅能够应用于普通液体， 还能应用于活细胞的氧气微 环境构建和实时监测。 [0004]比如， 2019年诺贝尔生理医学奖就颁发给了细胞的氧气感受器HIF ‑1的相关科学 家， 表彰他们 “发现了细胞如何感知和适应氧气供应 ”， 细胞感知到的外部氧气环境和自身 内部对氧气环境的适应通常非同步， 要能够精准的探究细胞内部和外部氧气分压的差异， 就需要能够适用于活细胞培 养的实时氧气调控与检测方法。 [0005]再比如， 在荧光显微成像方面， 时间分辨成像是一种结合长寿命发光染料来克服 生物自发光背景 的荧光成像技术， 然而， 由于目前产生长寿命的染料通常是通过三重激发 态物种间接获得的， 而三重态物种会非常容易被氧气淬灭， 因此， 氧气淬灭长信号的问题 导 致这一领域的发展受到限制 。 如果能在活细胞成像时对微环境中氧气浓度进行有效调控， 将解决时间分辨成像/荧光寿命成像中长寿命信号被淬灭的问题， 可以实现对溶液及细胞 微环境进行高分辨 率、 高灵敏度的实时探测， 进一 步拓展一系列相关领域的发展。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供氧气浓度梯度微环境的构建方法， 为实现上述目的， 本发 明提供如下技 术方案， 包括以下步骤： [0007]S1.试样的配制及注入 [0008]当测试样品为荧光染料溶液时： 将其在溶剂中稀释到合适浓度， 通入芯片主通道 及测试腔室。 [0009]当测试样品为非贴壁细胞时： 如细 菌等， 需要将其与氧气敏感探针孵育染色， 根据 染料性质进行离心和洗涤操作后， 通入芯片主通道及测试腔室。 [0010]当测试样品为贴壁细胞时： 如哺乳动 物细胞等， 将待测细胞通入芯片主通道中， 在 37℃细胞培养箱中培养12小时， 细胞贴壁后， 使用对氧气有荧光响应信号的荧光染料对活说　明　书 1/7 页 3 CN 114894761 A 3