(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210492754.8 (22)申请日 2022.05.07 (71)申请人 北京航空航天大 学 地址 100000 北京市海淀区学院路37号 (72)发明人 常凌乾　董再再　万凤奇　 (74)专利代理 机构 北京睿博行远知识产权代理 有限公司 1 1297 专利代理师 董自亮 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种活细胞内增强子活性 鉴定方法与装置 (57)摘要 本公开提供了一种活细胞内增强子活性鉴 定方法与装置， 用于实现 活细胞内增强子活性的 灵敏检测。 本公开中采用纳米电穿孔生物芯片 对 细胞质膜进行高度聚焦穿孔， 并提供驱动力， 加 速增强子探针向细胞核的递送。 增强子探针采用 循环扩增策略设计， 在1小时内将荧光信号提高 100倍以上。 在实施例中， 该方法与装置成功实现 活细胞内CCAT1增强子的活性检测， 同时细胞活 性不受影 响， 证实了本公开中提出的方法及装置 在检测活细胞中增强子活性方面的稳健性和可 靠性。 本公开为活细胞内增强子基因调控机制研 究与临床应用诊断提供了 便利的通用平台。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 114965394 A 2022.08.30 CN 114965394 A 1.一种活细胞内增强子活性鉴定装置， 其特征在于： 包括增强子探针和纳米电穿孔生 物芯片， 所述的增强子 探针设置在 纳米电穿 孔生物芯片内部； 所述的增强子 探针通过放大的信号特异性 地反馈增强子的活性状态； 所述的纳米电穿 孔生物芯片用于向活细胞核内递送增强子 探针。 2.根据权利要求1所述的一种活细胞内增强子活性鉴定装置， 其特征在于： 所述的增强 子探针由一组DNA序列组成， 通过循环荧 光信号放大策略， 实现检测信号的放大。 3.根据权利要求1所述的一种活细胞内增强子活性鉴定装置， 其特征在于： 纳米电穿孔 生物芯片， 由五个部分组成， 从下到上分别是： 下电极、 探针储存室、 纳米孔层、 细胞培养室 和上电极； 其中， 下电极的作用为连接电穿孔仪的负极； 探针储存室用于存放待递送的探针 溶液； 纳米孔层用于聚焦电场， 同时提供探针由探针储存室移动进入细胞内的通道； 细胞培 养室用于细胞的贴壁培 养； 上电极的作用为连接电穿 孔仪的正极， 并与下电极形成通路。 4.根据权利要求2所述的一种活细胞内增强子活性鉴定装置， 其特征在于： 所述的DNA 序列， 包括P1、 P2、 H1和H2四种功能序列： P1： 由三部分构成， 包括与增 强子序列结合的部分， 与启动子序列结合的部分， 以及以 上两部分间的连接 部分； P2： 与P1中与启动子序列结合的序列部分互补结合； H1： 自身序列部分互补， 具有含一个粘性末端的 “发卡”结构， 使标记的荧光基团因接近 其标记的淬灭基团而发生 荧光淬灭； H2： 自身序列部分互补， 具有含一个粘性末端的 “发卡”结构。 5.根据权利要求2所述的一种活细胞内增强子活性鉴定装置， 其特征在于： 所述的循环 荧光信号放大策略如下： 序列P2能够结合序列H1， 并打开H1的 “发卡”结构， 恢复H1上的荧光 信号， 进而H2可与序列H1结合， 并将 H1上结合的序列P2 替换下来， 替换的P2可继续与序列H1 结合， 循环触发荧 光恢复反应。 6.根据权利要求3所述的一种活细胞内增强子活性鉴定装置， 其特征在于： 纳米孔层具 有1‑1000纳米的通 孔， 材质为聚碳 酸酯或硅 。 7.根据权利要求3所述的一种活细胞内增强子活性鉴定装置， 其特征在于： 所述的纳米 电穿孔生物芯片具有细胞质膜穿 孔并产生推动力促进增强子 探针进入细胞核。 8.利用权利要求1 ‑7任一所述装置进行的一种活细胞内增强子活性鉴定方法， 实现该 方法的过程如下： 装置的下电极连接电穿孔仪的负极， 上电极连接电穿孔仪的正极， 通过电 穿孔仪施加方波脉冲电压， 纳米孔层发挥聚焦电场的作用， 实现细胞膜的安全、 可逆穿孔， 同时产生电泳力使纳米孔层下方 的探针加速通过纳米孔层， 并进入穿孔的细胞内， 进入细 胞内的探针继续在电泳力的作用下通过细胞核孔进入至细胞核内； 进入细胞核内的探针首 先由P1特异性结合增强子序列， 当增强子在激活状态下与启动子相互作用时， P1的另外一 个末端与启动子序列结合， 使原本结合在P1上的P2被替换下来； 替换下来的P2与 发卡形状 的H1结合， 使H1的发卡形状打开， 从而令荧光基团远离淬灭基团发出荧光； 随后， H2与H1互 补结合， 使P2序列替换下来； 被替换下来的P2探针继续与发卡形状的H1结合， 由此开启新一 轮的荧光恢复与序列替换 的循环； 经过多次循环后， 原本仅由一个增强子相互作用替换下 来的P2， 实现多倍的荧 光信号放大， 增加检测灵敏度。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114965394 A 2一种活细胞内增强子活性 鉴定方法与装置 技术领域 [0001]本发明属于细胞生物 分析技术领域， 特别涉及一种活细胞内增强子活性鉴定方法 与装置。 背景技术 [0002]增强子是细胞核内基因组中的一类非编码调控元件， 其由转录因子引导， 与启动 子相互作用而激活， 能够显著提高特定基因的表达。 可控的增强子激活在维持哺乳动物细 胞内基因的进化中发挥了重要作用。 相对地， 失控的增强子激活会导致一系列异常的细胞 行为， 如肿瘤的发生与过度增殖。 识别增强子的活性， 特别是在活细胞中， 能够为探索癌症 的潜在基因调控机制提供重要 线索。 [0003]传统的基因测序方法， 如染色质免疫沉淀测序(ChIP ‑seq)， 已被应用于研究增强 子活性。 ChIP ‑seq方法中， 使用抗体从片段化的基因组中捕获转录因子， 并通过对 结合在转 录因子上的增强子和启动子进 行测序， 以检查目标增强子的激活状态。 值得注 意的是， 这种 方法需要进 行耗时的后续验证实验， 以排除源自基因组片段化带来的人为干扰。 此外， 由于 需要从裂解的细胞中提取基因组， 此类基于基因测序的方法无法实时地反馈增强子的状 态。 [0004]在活细胞中研究增强子 的活性主要面临着两个障碍： (1)细胞质膜和核膜的双重 生物屏障。 现有的大多数分子递送技术， 通过将探针装载在载体上， 例如纳米颗粒、 脂质体 等， 利用细胞的内吞作用将 探针递送至细胞内， 仅能使探针跨过细胞质膜的阻碍， 而 无法继 续将探针带入细胞核内， 即意味着不能实现细胞核内增强子活性的鉴定。 (2)检测方法的高 灵敏性。 由于增强子是通过与启动子相互作用而激活， 检测目标增强子活性即是识别这种 相互作用。 由于增强子与启动子相互作用位点的唯一性， 这就要求检测方案具有极高的灵 敏性。 据本公开前期对已有方法的调研， 还未有报道 能够同时解决以上两大障碍实现活细 胞内增强子活性检测的方法。 发明内容 [0005]本发明具体提出了一种活细胞内增强子活性鉴定方法与装置， 解决了上述两个障 碍， 实现了对活细胞中核内增强子活性的灵敏检测。 该活细胞内增强子活性鉴定方法与装 置结合了用于核内递送的纳米电穿孔生物芯片和增强子探针的优势。 纳米电穿孔生物芯片 实现了对细胞质膜的聚焦穿孔， 并产生电泳力将增强子探针高效且安全的送入细胞核内； 根据循环荧光信号放大策略设计的增强子探针， 在检测目标增强子活性方面表现出高灵敏 度和响应性。 利用本公开中的方法与装置， 全部检测过程可在一小时内完成， 为增强子相关 机制研究提供了便利的研究手段， 为增强子活性成为新的临床癌症诊断标志物奠定了基 础。 [0006]本发明采用的技术方案为一种活细胞内增强子活性鉴定装置， 包括增强子探针和 纳米电穿 孔生物芯片， 所述的增强子 探针设置在 纳米电穿 孔生物芯片内部 。说　明　书 1/6 页 3 CN 114965394 A 3