(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210456709.7 (22)申请日 2022.04.28 (71)申请人 浙江工业大 学 地址 310000 浙江省杭州市拱 墅区潮王路 18号 (72)发明人 徐颖　徐宁　祝俏俏　 (74)专利代理 机构 浙江千克知识产权代理有限 公司 33246 专利代理师 冷红梅 (51)Int.Cl. G01N 21/65(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种单细胞脂代谢表型的快速 检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种单细胞脂代谢表型的快速 检测方法。 本发 明根据野生型和基因敲除型细胞 的拉曼光谱 具备特征建立聚类区分模 型， 采用无 标记拉曼光谱的原位检测， 并根据制定的谱峰比 区分标准， 实现了细胞内脂代谢表型的快速识 别， 且无需将样本进行过度处理， 只需将细胞固 定在爬片上， 极大缩短了检测时间， 便于快速检 测。 本发明具有准确度高、 样本量少 、 操作时间短 并可视化等优点， 可以扩展到其他细胞类型的脂 质区分， 并可能在自动细胞脂质表型识别和分类 中具有很大的用途。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 114965420 A 2022.08.30 CN 114965420 A 1.一种单细胞脂代谢表型的快速检测方法， 包括如下顺序步骤： （1） 将待测细胞在  37℃、 5% CO2 加湿培养箱培养12~24小时； （2） 用4%多聚甲醛固定细胞， 并用PBS  和 H2O 洗涤然后晾干， 得到用于后续 拉曼数据采 集的细胞样本； （3） 采用显微共聚焦拉曼光谱仪收集单个细胞的拉曼光谱， 选取拉曼代表峰值： 1656， 2852， 2930和3013 cm‑1， 得到3个拉曼谱峰比： I1656/I3013， I2852/I3013和 I2930/I3013； 结果判断： 若I1656/I3013比值在0~2， 则待测细胞归属于WT细胞， 若I1656/I3013比值大于2， 则待测细胞归属于KO细胞； 若I2852/I3013比值在1~2， 则待测细胞归属于WT细胞， 若I2852/I3013 比值大于4， 则待测细胞归属于KO细胞； 若I2930/I3013 比值在0~5， 则待测细胞归属于WT细胞， 若I2930/I3013 比值大于 5， 则待测细胞归属于KO细胞。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于所述待测细胞为HeLa细胞， 所述的HeLa ‑KO细 胞为HeLa ‑WT细胞中CDK6基因被敲除的细胞。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于步骤 （3） 拉曼检测条件为： 采用  532nm/514nm/ 633激发波长， 20~30 mW功率， 0.3~0.5 μm步长， 6 0  ×倍镜， 0.2~0.4 s累积时间。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114965420 A 2一种单细胞脂代谢表型的快速检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种单细胞脂代谢表型的快速检测方法， 尤其涉及 一种针对基因敲除 前后单细胞脂质代谢表型改变的检测区分方法。 背景技术 [0002]细胞表型是由基因表达的一种外部性状， 是涉及基 因和蛋白质表达的多个细胞过 程的集合体， 从而导致特定的细胞形态和功能。 作为改变细胞表型的一种手段， 基因敲除技 术被广泛应用于研究遗传缺陷以确定靶基因的病理生理作用， 已成为许多 领域必不可少的 研究方法。 基因敲除后的表型鉴定是探索相关基因、 蛋白质和药物之间相互作用机制的方 法中最不可或缺的一项。 脂质是细胞中的主要能量存储， 并为生物膜提供结构 完整性。 脂质 代谢改变是癌症中最突出的代谢改变之一。 脂质代谢失调 与许多人类疾病有关， 例如癌症， 肥胖症和糖尿病等。 [0003]荧光激活细胞分选、 免疫化学染色、 逆转录酶实时定量聚合酶链反应  （QRT‑PCR）  和蛋白质印迹等常规方法已被广泛用于区分细胞表型。 然而， 这些方法中的大多数需要破 坏性固定或荧光探针， 通常很耗时。 这些方法大多需要许多细胞群， 无法捕捉到单细胞水平 的差异， 限制了它们在监测细胞表型中的应用。 细胞染色可能发生在单细胞水平。 但是， 它 仍然处于定性或半定量的水平。 因此， 细胞脂质代谢表型的快速无损检测、 鉴定仍然 具有挑 战性。 [0004]由于现有技术的细胞需求量大， 且费时费力， 无法捕捉到单细胞水平的差异。 因此 需要发明一种新方法来 解决上述 技术问题。 发明内容 [0005]针对上述的不足， 本发明的主要目的在于提供一种单细胞脂代谢表型的快速检测 方法。 [0006]本发明采用的技 术方案是： 一种单细胞脂代谢表型的快速检测方法， 包括如下顺序步骤： （1） 将待测细胞在  37℃、 5% CO2加湿培养箱培养12~24小时； 96孔板放入玻璃爬 片， 包括普通玻璃、 氟化钙玻璃、 石英玻璃材质， 优选石英玻璃。 接种细胞量1000~5000个每 孔， 针对HeLa细胞， 优选20 00个。 [0007]（2） 用4%多聚甲醛固定爬片上的细胞， 并用PBS  和 H2O 洗涤然后晾干， 得到用于 后续拉曼数据采集的细胞样 本； 可选雷尼绍公司、 WITec公司、 HORIBA公司等的显微镜， 优选 WITec公司的W ITec alpha 300 Ri 显微共聚焦拉曼显微镜 。 [0008]（3） 采用显微共聚焦拉曼光谱仪收集单个细胞的拉曼光谱， 选取拉曼代表峰值： 1656， 2852， 2 930和3013 cm‑1， 得到3个拉曼谱峰比： I1656/I3013， I2852/I3013和 I2930/I3013； （4） 结果判断： 若I1656/I3013比值在0~2， 则待测细胞归属于WT细胞 （野 生型细胞） ， 若 I1656/I3013比值大于2， 则待测细胞归属于KO细胞 （基因敲除型细胞） ； 若I2852/I3013比值在1~说　明　书 1/5 页 3 CN 114965420 A 3