(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210770685.2 (22)申请日 2022.06.30 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M 202 2565 2022.05.09 CCTCC NO： M 202 2566 2022.05.09 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 饶志明　尤甲甲　杨套伟　潘学玮　 张显　徐美娟　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 张梦泽 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/21(2006.01)C12N 15/55(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 15/61(2006.01) C12P 25/00(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一株枯草芽孢杆菌、 一种重组枯草芽孢杆菌 及其应用 (57)摘要 本发明提供了一株枯草芽孢杆菌、 一种重组 枯草芽孢杆菌及其应用， 属于微生物发酵技术领 域。 本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtili s) RF1‑6是以核黄 素高产菌株RF 1作为出发菌株， 经 过基因改造和诱变， 筛选得到的核黄素产量最高 的突变株， 保藏编号为CCTCCNO： M2022565。 与核 黄素高产菌株RF1相比， 核黄素产量能够提高 22.8％。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 114958693 A 2022.08.30 CN 114958693 A 1.一株枯 草芽孢杆菌(Baci llus subtilis)RF1‑6， 保藏编号 为CCTCC NO： M 2022565。 2.一种重组枯草芽孢杆菌， 以权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)RF1 ‑ 6作为原始菌株， 包 含重组质粒； 所述重组质粒 上插入有zwf基因、 yw lf基因和ribBA基因； 所述重组质粒的原 始质粒优选为pMA5 ‑sat； 所述zwf基因、 ywlf基因和ribBA基因优选的以同源重组的方式连接到所述原始质粒 上。 3.根据权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述zwf基因、 ywlf基因和 ribBA基因顺次插 入在所述重组质粒的E coRI和Kpn I酶切位点之间。 4.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述重组质粒上还插入有强 启动子P43。 5.根据权利要求4所述 的重组枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述强启动子P43插入在zwf 基因上游的E coRI酶切位 点处。 6.根据权利要求2～5任意一项所述的重组枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述重组枯草 芽孢杆菌中pgi基因敲低。 7.根据权利要求2～5任意一项所述的重组枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述重组枯草 芽孢杆菌中purR基因敲除。 8.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述重组枯草芽孢杆菌包括 枯草芽孢杆菌RF1 ‑6ZYRS， 保藏编号 为CCTCC NO： M2022566。 9.一种菌剂， 包括权利要求1所述枯草芽孢杆菌或者包括权利要求2～8任意一项所述 的重组枯 草芽孢杆菌 。 10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌RF1 ‑6或者权利要求2～8任意一项所述的重组枯草 芽孢杆菌或者权利要求9所述的菌剂在合成核黄素中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958693 A 2一株枯草芽孢杆菌、 一种重组枯草芽孢杆菌及其应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物发酵技术领域， 具体涉及一株枯草芽孢杆菌、 一种重组枯草芽 孢杆菌及其应用。 背景技术 [0002]核黄素， 又称维生素B2， 是一种独特的水溶性维生素， 具有见光易分解的特性。 它 最初是在1879年从乳清中分离出来的， 并被命名为牛奶色素。 核黄素可以结晶成橘黄色的 晶体， 但其纯形态很难溶于水， 可溶于氯化钠溶液， 易溶于稀的氢氧化钠溶液， 在碱性溶液 中容易溶解， 在强酸溶液中稳定。 它主要由植物和微生物合成， 是一种重要的动物营养物 质。 它对动物来说是一种重要的营养物质， 需要从外界获取。 核黄素在动物体内转化为两种 活性物质:黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核核苷酸(FMN)， 作为氧化还原酶氧化途径 酶的辅因子， 参与一系列氧化还原反应， 其中一些对有氧细胞的功能至关重要。 当缺乏时， 就影响机体的生物氧化， 使代谢发生障碍 。 其病变多表现为口、 眼和外生殖器部位的炎症。 [0003]核黄素主要用于医药、 食品添加剂、 饲料加工等行业， 也被用于临床上癌症治疗和 预防。 目前国内外广泛采用微生物发酵法工业生产核黄素， 能够合成核黄素 的微生物有细 菌、 真菌和霉菌， 工业生产中主要以枯草芽孢杆菌和阿舒假囊酵母作为生产菌株。 目前文献 中报道的枯草芽孢杆菌合成核黄素的最高产量为15.7g/L(参见 【Wang， Z.， Ch en， T.， Ma， X.， Shen， Z.and  Zhao， X.Enhancement  of riboflav in production  with Bacillus  subtilis   by expression  and site‑directed  mutagenesis  of zwf and gnd gene from  Corynebacterium  glutamicum[J].Bioresour ce Technology,2011,102(4):3934 ‑3940】 )， 但是这一产量仍无法满足工业 生产需求。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌、 一种重组枯草芽孢杆菌及 其应用， 本发明的枯 草芽孢杆菌和重组枯 草芽孢杆菌的核黄素产量高。 [0005]本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)RF1 ‑6， 保藏编号为 CCTCCNO： M 2022565。 [0006]本发明还提供了一种重组枯草芽孢杆菌， 以上述方案所述枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)RF1 ‑6作为原始 菌株， 包含重组质粒； 所述重组质粒上插入有zwf基因、 ywlf基因和ribBA 基因； 所述重组质粒的原始质粒优选为pMA 5‑sat； 所述zwf基因、 ywlf基因 和ribBA基因优选的以同源重组的方式连接 到所述原 始质粒上。 [0007]优选的， 所述zwf基因、 ywlf基因和ribBA基因顺次插入在所述重组质粒的EcoRI和 KpnI酶切位点之间。 [0008]优选的， 所述重组质粒 上还插入有强启动子P43。 [0009]优选的， 所述强启动子P43插入在zwf基因上游的E coRI酶切位 点处。 [0010]优选的， 所述重组枯 草芽孢杆菌中pgi基因敲低。说　明　书 1/5 页 3 CN 114958693 A 3