(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210826474.6 (22)申请日 2022.07.13 (71)申请人 广西壮族自治区农业科 学院 地址 530000 广西壮 族自治区南宁市大 学 东路174号 (72)发明人 林丽　黄冬梅　 (74)专利代理 机构 济南市新图新夏天专利代理 事务所(普通 合伙) 37330 专利代理师 潘灿标 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/06(2006.01) A01G 31/00(2018.01)A01G 22/55(2018.01) A01G 7/06(2006.01) A01G 24/15(2018.01) A01G 24/10(2018.01) C12R 1/41(2006.01) (54)发明名称 一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的 研究方法 (57)摘要 本发明涉及甘蔗种植研究技术领域， 尤其涉 及一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研 究方法。 其主要针对现有技术中根瘤菌在甘蔗中 应用的详细研究方案欠缺等问题， 提出如下技术 方案： 步骤一： 采样； 步骤二： 分离细菌； 步骤三： 鉴定细菌； 步骤四： 细菌内生性检测； 步骤五： 研 究CZGRD1在不同基因型甘蔗体内的定殖组织模 式； 步骤六： 利用15N同位素稀释技术检测联合固 氮。 本发明提出的根瘤菌促进甘蔗苗生长和根瘤 菌能与甘蔗联合固氮的研究， 为甘蔗的低氮高效 种植提供理论依据， 并结合实际运用， 有利于提 高甘蔗的产量等特性， 有利于促进甘蔗低氮种植 的发展， 主要应用于根瘤菌对甘蔗种植的影响技 术。 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 CN 115181670 A 2022.10.14 CN 115181670 A 1.一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征在于： 包括以下研究处 理步骤： 步骤一： 采样； 取野外旱坡地割手密的根， 存放在塑封袋中， 目的用于分离固氮菌； 步骤二： 分离根瘤菌； 取步骤一中割手密根冲洗清除附着的泥土， 取每株割手密植株的 鲜根5g， 经由处理后研磨成匀浆， 匀浆液稀释处理后铺在无氮的YMA培养基上， 经由特定的 培养环境长出迗单菌落在Y MA培养基上划线培 养3次纯化菌株； 步骤三 ： 鉴定细菌 ； 用引物799f/1492r (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/ GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增各固氮菌的16SrDNA片段(约73 5bp),测序鉴定根瘤菌的归属； 步骤四： 根瘤菌内生性检测； 筛选出根瘤菌以约每毫升培养基含约1*105活细菌的量与 甘蔗组培苗在无植物激素和维生素的1/10MS 基本培养液中培养， 并对培养后的蔗苗处理后 分开蔗苗的根和地上苗， 浸入无菌磷酸缓冲盐液中研磨匀 浆； 匀浆液用磷酸缓冲盐液10倍 系列稀释， 各取100 μl铺在培养基上； 待菌落长成， 计数根瘤菌在蔗苗内的数量， 评估根瘤菌 的内生定殖能力； 步骤五： 研究CZGRD1在不同基因型甘蔗体内的定殖组织模式； 将甘蔗组培苗的整条根 切成几段制备观察样本， 结合共聚焦显微镜和透射电镜观察扫描； 步骤六： 利用15N同位素稀释技术检测联合固氮； 选用新台糖22号RB928064组培苗作为 试验种苗， 用15N稀释法计算蔗苗中来源于N2的固氮率。 2.根据权利要求1所述的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征 在于， 所述步骤二中割手密研磨成匀浆之前， 将获取的每株割手密植株的鲜根在氯氨T溶液 中搅拌， 搅拌时间为 15min， 并取出后通过无菌水冲洗根样6次； 匀浆液稀释处理采用磷酸 缓 冲盐液10倍系列稀释， 稀释后的匀浆液 取100 μl铺在无氮的Y MA培养基上。 3.根据权利要求1所述的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征 在于， 所述 步骤二中特定的培 养环境为： 培养温度条件为28℃， 培 养周期时间为5 ‑15天。 4.根据权利要求1所述的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征 在于， 所述步骤四中采用Lin等(2012)的方法进行根瘤菌的内生性检测； 固氮菌与甘蔗组培 苗在基本培养基中培养时间为7天； 培养后的蔗苗处理包括以下处理步骤： a、 蔗苗用70％的 乙醇浸泡1mi n； b、 1％(w/v)氯铵 T溶液浸泡15mi n； c、 无菌水冲洗 6次。 5.根据权利要求1所述的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征 在于， 所述步骤五中共聚焦显微镜和透射电镜观 察扫描过程为以下程序： ①、 将观察样 本用 0.25％的琼脂糖封在两层盖玻片间， 所述盖玻片的尺寸为24mm*60mm； ②、 采用LeicaTCS   SP5 LSCM配置的倒 置Leica DMI 6000显微镜的I3滤镜(BP450－490， DM510， LP515)通光照 射根样， 用10*0.40、 20*0.70和40*0.60物镜观察； ③、 对选定位点用488nm激光激发， 用 500nm‑530nm带检测GFP荧光， 在600nm ‑800nm间调整带宽检测根的自发荧光； ④、 用LASAF程 序控制xy平 面扫描以1 μm步距沿z轴从根表向根内逐层进 行， 依需要和激光扫描深度的限制 及可采集 根自发荧 光的限制， 扫描距离在5 0 μm到150 μm间。 6.根据权利要求1所述的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征 在于， 所述步骤六中新台糖22号RB928064经由以下处理步骤后再进行固氮率的计算， 具体 包括以下处理步骤： S1、 组培苗移入基质中炼苗2周,再移入均匀混有稳定同位素15N (10.11atom％)硫酸铵(10mg/kg)的基质； S2、 选用不接种组培苗为对照； S3、 移栽5天后， 通权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115181670 A 2过添加无糖的1/10MS基本盐溶液的量控制基质氮含量； S4、 过70天检测接种蔗苗与S2中不 接种对照蔗苗的干重、 氮含量和各种酶活性； S5、 将蔗苗烘干后采用研磨机充分研细， 取 10mg干粉用DeltaP lusADEA‑IRMS质谱仪测定15N同位素含量； S6、 采用15N稀释法计算蔗苗中 来源于N2的固氮率。 7.根据权利要求6所述的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征 在于， 所述S1中的基质为沙和珍 珠岩， 所述沙与珍 珠岩的质量比为1:1。 8.根据权利要求6所述的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征 在于， 所述S6中固氮率的计算公式为： Ndfa＝100*[1 ‑(接种蔗苗15Natom％/不接种对照蔗 苗15Natom％)]。 9.根据权利要求1所述的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法， 其特征 在于， 所述 步骤五中CZGRD1的平均尺寸 为1.1‑1.5 μm*0.8‑1.0 μm。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115181670 A 3