(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210663917.4 (22)申请日 2022.06.10 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO.2497 7 2022.05.26 (71)申请人 中国科学院微生物研究所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路一 号 院3号 (72)发明人 李爱华　王蕊　刘紫轩　普布多吉 　 周宇光　 (74)专利代理 机构 北京华际知识产权代理有限 公司 11676 专利代理师 袁瑞红 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 17/12(2006.01)C07D 239/06(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一株盐单胞菌 菌株及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株盐单胞菌菌株及其应用， 所述菌株为盐单胞菌属(Halomonas)中的新种， 保藏编号为CGMCC  NO.24977。 本发明中分离获得 的菌株C2 ‑1‑M8， 是不同于Halomonas属已知种的 新种， 并且可在胞内合成四氢 嘧啶(Ectoine)。 菌 株C2‑1‑M8可以利用D ‑果糖、 甘油、 D ‑果糖‑6‑磷 酸、 L‑丙氨酸、 L ‑组胺、 L‑丝氨酸、 D ‑半乳糖醛酸、 D‑葡糖醛酸、 葡糖醛酰胺、 L ‑乳酸、 D‑苹果酸、 L ‑ 苹果酸、 吐温40等底物， 具有底物广谱性。 根据生 理生化实验， 菌株C2 ‑1‑M8的生长温度为4℃ ‑30 ℃， 生长所需NaCl浓度为1.0％ ‑17.0％， 生长pH 值为5.0‑7.5。 同时， 菌株C2 ‑1‑M8在30℃、 NaCl浓 度为5.0％ ‑9.0％、 pH5.5 ‑7.0的条件下合成四氢 嘧啶的产量最佳。 该菌株在生物制备四氢嘧啶中 具有非常广泛的应用前 景。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 114806974 A 2022.07.29 CN 114806974 A 1.一株盐单胞菌菌株， 其特征在于， 所述菌株为盐单胞菌菌株C2 ‑1‑M8(Halomonas   sp.)， 保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心， 保藏编号 为CGMCC 24977。 2.根据权利 要求1所述的盐单胞菌菌株， 其特征在于， 所述菌株的16S  rRNA基因序列如 SEQ.NO.1所示。 3.权利要求1所述的盐单 胞菌菌株制成的发酵 液及液体菌剂。 4.一种权利要求3所述的发酵 液及液体菌剂的制备 方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 1)菌株活化： 挑取菌种划线接种至22 16固体培养基， 置于恒温培养箱中， 30℃下培养14 ～20h； 2)种子液的制备： 挑取活化的菌体接种至装有种子培养基的大试管中， 橡胶塞封口， 置 于30℃的摇床上， 16 0～200rpm振荡培 养16‑24h， 得种子液； 3)液体发酵： 然后将种子液和 发酵培养基以体积比5 ‑10％的接种量进行扩大培养， 培 养条件为30℃， 150rpm； 振荡培养48h得到的培养物即为发酵液； 将发酵液以12000rpm离心 10min， 收集菌体。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述种子培养基为2216液体培养基， 所述 2216液体培养基配方为： 蛋白胨5.0g、 酵母提取物1.0g、 柠檬三铁0.1g、 氯化钠19.45g、 氯化 镁8.8g、 亚硫酸钠3.24g、 氯化钙1.3 g、 氯化钾0.55 g、 碳酸氢钠0.16 g、 溴化钾0.08g、 氯化锶 34.0mg、 硼酸22.0mg、 硅酸钠4.0mg、 氟化钠2.4mg、 硝酸铵1.6mg、 磷酸氢二钠8.0mg， 琼脂 15.0g， 加蒸馏水定容至1000mL， 121℃灭菌20min； 所述2216 固体培养基的配方是2216液体 培养基的基础上添加琼脂15.0g； 所述发酵培养基是在2216液体培养基的基础上添加NaCl 至浓度为5.0 ‑9.0％。 6.权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基是在2216液体培养基的基础上 添加NaCl至浓度为9.0％。 7.权利要求4所述的方法， 其特征在于， 制备所得发酵液和液体菌剂中活菌总 浓度均为 1.94×109cfu/mL‑1.99×109cfu/mL。 8.权利要求1所述的盐单胞菌菌株或权利要求3所述的发酵液及液体菌剂在生物合成 四氢嘧啶中的应用。 9.权利要求3所述盐单胞菌发酵液和液体菌剂中四氢嘧啶的提取方法， 其特征在于， 所 述方法包括如下步骤： 1)按照权利要求 4所述的方法制备发酵 液及液体菌剂； 2)将发酵液于12000rpm离心10min， 收集菌体； 用磷酸氢二钾 ‑磷酸二氢钾缓冲液悬浮 菌体， 12000rpm离心10min， 弃上清， 收集菌体； 然后用2ml  80％的乙醇充分悬浮菌体， 室温 振荡过夜， 再次120 00rpm离心10mi n， 取上清液， 所述上清液中含有四氢嘧啶。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述磷酸氢二钾 ‑磷酸二氢钾缓冲液的pH 值为7.0。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114806974 A 2一株盐单胞菌 菌株及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 微生物技术领域， 具体涉及一株盐单胞菌菌株及其在合成四氢嘧啶中 的应用。 背景技术 [0002]中度嗜盐菌是指能在NaCl浓度为0.1％ ‑32.5％的环境中生长的微生物类群。 它们 为了抵御高渗透压逆境对自身的损害， 维持细胞内外的渗透压平衡， 会在体内合成有机渗 透物， 如谷氨 酸、 脯氨酸， 甘氨酸， 甜菜碱， 海藻糖， 四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶等。 四氢嘧啶作 为相容性溶质既可以作为核酸、 酶、 细胞膜等生物大分子的稳定剂， 帮助细胞抵抗如高盐、 高温、 冰冻、 干燥等逆境， 也能作为分子伴侣， 通过识别蛋白质的错误折叠来抑制蛋白质聚 合体的形成。 [0003]四氢嘧啶是由Galinsk等于1985年从Ectothiorhodospira  halochloris DSM   1059中首次发现并鉴定出结构， 是一种环化的氨基酸衍生物。 性质稳定， 不易分解， 分子式 为C6H10O2N2， 分子量为142.16， 溶于水、 甘油、 甲醇、 乙醇、 丙二醇等， 不溶于二甲基 亚砜、 三氯 甲烷。 [0004]目前， 科学家己从分子水平阐明了在嗜盐海球菌Marinococcus halophilus、 巴斯 德氏盐水芽孢杆菌Salibacillus  pasteurii和需盐色盐杆菌  Chromohalobacter   salexigens中四氢嘧啶的合成途径。 该过程由天冬氨酸 ‑ β‑半醛开始， 形成的产物依次是 二氨基丁酸、 乙酰二氨基丁酸和四氢嘧啶。 依次由二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、 二氨基丁 酸乙酰转移酶(EctA)  和四氢嘧啶合成酶(EctC)催化完成。 且ectA、 ectB和ectC基因组成一 个操纵子， 受共同的启动子调控。 [0005]近年来， 相容性溶质的渗透保护功能以及在不同领域内如化妆品领域、 分子基因 工程的应用越来越受到重视。 四氢嘧啶 能够作为稳定剂保护和稳定酶、 DNA、 膜 等大分子， 具 有抗高盐、 抗干燥、 抗冷冻、 防止热变性等功能， 所以在 食品、 生物制药、 酶制剂、 农药以及化 妆品等领域都具有广泛的应用前景。 四氢嘧啶合成基因己经在烟草中得到表达， 尽管其表 达量比较低， 但耐盐性还是有一定的提高。 四氢嘧啶还被用来作为化妆品的保湿剂， 防止皮 肤干燥、 衰 老等。 如德国默克公司最近推出一套新兴化妆品， 包含的四氢嘧啶对胰岛细胞有 免疫作用、 能产生热激蛋白、 保护膜的完整性、 还可以减少皮肤因紫外线形成的晒斑。 [0006]化学合成四氢嘧啶的前体物(如二氨基丁酸)价格昂贵， 且四氢嘧啶分子中有一个 手性碳原子， 很难用化学方法合成。 四氢嘧啶的生产方法包括发酵法和酶催化法。 目前， 四 氢嘧啶主要是从Halomonas  elongata  中提取。 嗜盐微生物中含有四氢嘧啶的合 成途径， 因 此广泛用于发酵法生产四氢嘧啶。 目前已发现有许多耐盐菌及嗜盐菌可合成四氢嘧啶， 包 括Halomonas  elongata， Brevibacterium  epidermis， Marinococcus  strain M52，  Halomonas  boliviensis， Chromohalobacter  salexigen s， Halomonas venusta 等。 可利用 这些微生物采用 “细菌挤奶 ”工艺生产四氢嘧啶， 即高盐诱导下在细胞内合成四氢嘧啶， 然 后经低渗冲击细胞释放四氢嘧啶， 维持细胞内外渗透压平衡。 另外， 有研究人员用重组工程说　明　书 1/5 页 3 CN 114806974 A 3