(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210668015.X (22)申请日 2022.06.14 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M 202 2664 2022.05.19 (71)申请人 中国科学院青岛生物能源与过程研 究所 地址 266000 山东省青岛市崂山区松岭路 189号 (72)发明人 崔球　刘亚君　迟方　万伟建　 宋晓金　 (74)专利代理 机构 山东康裕律师事务所 3731 1 专利代理师 傅培 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/21(2006.01)C12N 15/74(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12P 19/02(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (54)发明名称 一株耐酸热纤梭菌及其降解木质纤维素的 方法 (57)摘要 本 发 明 提 供 了 一 株 耐 酸的 热纤 梭 菌 （Clostridium  thermocellum ） MT1105， 保藏于中 国典型培养物保藏中心 （CCTCC）， 保藏编号为 CCTCC NO： M 2022664， 保藏日期2022年5月19日。 所述的热纤梭菌MT1105在pH  5.6‑7.5、 50‑65℃ 较宽的条件 下均能正常生长且获得较高的生物， 具备耐酸性和 发酵鲁棒性。 其最适条件pH=6.0、 温度为60℃， 与纤维小体的最适酶活条件一致； 因此， 发酵过程无需额外调节pH， 解决了现有技 术中由于控制pH而导致的成本高昂、 控制方法复 杂的问题， 实现了木质纤维素底物的高效降解。 此外， 本申请提供了热纤梭菌重组菌株MT1105 ‑ BGL， 在高效降解预处理后的木质纤维素底物的 基础上， 可以表达可外泌的葡萄糖苷酶， 能够生 产可发酵糖； 不但操作简单、 降低了生产成本， 而 且提高了可发酵糖的产量。 权利要求书1页 说明书9页 CN 115029264 A 2022.09.09 CN 115029264 A 1.一株耐酸的热纤梭菌， 其特征在于： 所述热纤梭菌命名为热纤梭菌MT1105 （Clostridium  thermocellum ） ， 保藏于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 其保藏编号为 CCTCC NO： M 2022664， 保藏日期202 2年5月19日。 2.如权利要求1所述的热纤梭菌 MT1105在降解木质纤维素 方面的应用。 3.根据权利 要求2所述的应用， 其特征在于： 所述应用具体为将热纤梭菌MT1105用于降 解木质纤维素， 得到糖化液。 4.一株耐酸的热纤梭菌重组菌株， 其特征在于： 将葡萄糖苷酶表达质粒转化到权利要 求1所述的热纤梭菌 MT1105中， 即得到热纤梭菌 重组菌株MT1 105‑BGL。 5.如权利要求 4所述的热纤梭菌 重组菌株MT1 105‑BGL在降解木质纤维素 方面的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述应用具体为： （1） 制备种子液： 将重组 菌株厌氧条件下接种于发酵培养基中， 在一定条件下培养， 至对数生长中期， 得到种子液； （2） 糖化： 然后将种子液接种于含有木质纤维素底物的糖化培养基中， 在一定的温度和转速 下进行水解反应， 得到含有葡萄糖的糖液。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于： 步骤 （2） 中木质纤维素底物与糖化培养基 的固液重量体积比为2 ‑10%， 种子液与糖化培 养基的体积比为10%。 8.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于： 步骤 （1） 中发酵培养基的初始pH为5.6 ‑ 7.5， 培养的条件为： 55 ‑65℃的温度条件和150 ‑250 rpm的转速； 步骤 （2） 中水解反应的条件 为： 55‑65℃的温度条件和15 0‑250 rpm的转速 。 9.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于： 所述的发酵培养基为： 磷酸氢二钾2.9  g/ L， 磷酸二氢钾1.5  g/L， 碳酸氢铵1.1  g/L， 氯化钙0.15  g/L， 氯化镁0.5  g/L， 硫酸亚铁1.0   mg/L， 硫化钠0.5  g/L， 玉米浆8.0  g/L， 纤维素5  g/L； 所述的糖化培养基为： 磷酸氢二钾0.6   g/L、 磷酸二氢钾0.3  g/L、 硫酸铵1.1  g/L、 氯化钙0.1  g/L、 氯化镁0.5  g/L、 硫酸亚铁0.5   mg/L、 硫化钠0.2  g/L、 玉米浆5.0  g/L， pH为5.6 ‑7.5。 10.根据权利要求6 ‑9中任意一项所述的应用， 其特征在于： 所述的木质纤维素底物为 预处理后的木质纤维素底 物， 其中的木质素含量 不高于15%， 半纤维素含量 不高于20%。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029264 A 2一株耐酸热纤梭菌及其降解木质纤维素的方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物学领域， 具体涉及一株耐酸的热纤梭菌(Clostridium   thermocellum或  Acetivibrio  thermocellus)MT1105以及该菌以木质纤维素为底物生产 可发酵糖的方法。 背景技术 [0002]热纤梭菌是一种 在1926年首次分离获得的嗜热纤维素降解菌株， 并在1980年正式 定义为Clostridium  thermocellum， 具有专性厌氧、 产孢、 典型的革兰氏阳性细胞壁等特 征， 但革兰氏染色显示阴性。 热纤梭菌通常产生球形或长圆形的终端孢子， 从而 形成肿胀的 细胞。 此后， 热纤梭菌的分类地位几经变化， 2019年改为Acetivibrio  thermocellus。 虽然 热纤梭菌已经不再属于梭菌属， 但人们仍然习惯于将热纤梭菌等纤维素降解厌氧菌称为梭 菌； Clostridium thermocel lum和Acetivibri o thermocel lus两种拉丁名称也都在使用。 [0003]热纤梭菌通过生产胞外纤维小体来降解纤维素。 纤维小体是木质纤维素高效降解 的天然“分子机器 ”， 通过模块间非共价的特异性相互作用将具有不同催化功能的酶组分 (纤维素酶、 半 纤维素酶等)组装成一种多酶复合体。 热纤梭菌主要生产复杂纤维小体， 具有 两级甚至三级组装结构， 组装形成的纤维小体不但结构复杂度高、 单元模块功能多样、 数量 巨大， 而且表达纤维小体元件的基因也大多在基因组中分散分布， 具有更为复杂的调控表 达方式和更为高效的纤维素降解活力。 除了产纤维小体的纤维素降解梭菌， 研究人员还发 现了通过生产 游离的纤维素酶来降解纤维素的梭菌， 但这些梭菌降解纤维素的能力远低于 热纤梭菌 。 [0004]由于纤维素降解的过程发生在胞外， 纤维素降解梭菌(特别是具有更高降解效率 的嗜热梭菌)被认 为是一种全细胞催 化剂， 可以实现纤维素到可发酵糖的催化转化， 并已实 现在秸秆等生物质的生物转化中的应用。 整合生物糖化技术是一种木质纤维素生物转化的 新策略， 其采用热纤梭菌等可实现原位产酶微生物为高效全细胞催化剂， 以低 成本发酵糖 为目标产物， 通过偶联下游发酵工艺， 极大 的拓宽了木质纤维素生物转化产品的品类和市 场。 木质纤维素全细胞糖化是整合生物糖化技术的核心步骤。 该步骤是热纤梭菌活细胞作 为生物催化剂， 通过生产胞外的纤维小体实现木质纤维素底物的高效降解， 进而转化为可 发酵糖的过程。 因此， 热纤梭菌 本身的抗逆性和对环境的耐受性尤为关键 。 [0005]已知的热纤梭菌菌株的最适pH生长范围在6 .7 ‑7 .0之间(Freier ,D ., C.P.Mothershed  and J. Wiegel(1988)."Characterization  of Clostridium   thermocellum Jw20."Appl  Environ Microbiol 54(1):204 ‑211.)。 一旦超过该范围， 会造 成菌株生长的极大延滞和生物量的显著降低， 当pH  低于6.2时， 菌株则完全停止生长。 然 而， 热纤梭菌作为厌 氧菌， 生长代谢过程中会产生乙酸、 乳酸、 甲酸等 终产物， 丙酮酸等中间 代谢产物也会发生积累， 导致 发酵过程中pH发生快速的下降， 从而影响菌体的生长。 为了解 决这一问题， 通常采用添加MOPS等昂贵的缓冲体系的方式降低pH下降的趋势， 延长菌体生 长的时间， 但这会导致培养体系的成本高昂。 另外， 还可以在发酵体系中通过酸碱控制， 将说　明　书 1/9 页 3 CN 115029264 A 3