(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210709504.5 (22)申请日 2022.06.22 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO. 24848 202 2.05.09 (71)申请人 湖南更好愿景生物科技有限公司 地址 410200 湖南省长 沙市望城经济开发 区杨家湾路49 9号 (72)发明人 张爱平　黄兴江　张晓明　 (74)专利代理 机构 南京新慧恒 诚知识产权代理 有限公司 32424 专利代理师 王月霞 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株能利用废水发酵生产纳 豆激酶的菌株及其应用， 主要利用豆制品加工废 水与柑橘深加工过程中产生的废水作为发酵基 质， 替代培养基中的碳氮源， 采用高产纳豆激酶 的 生 产菌 株 ， 分 类 命 名为 枯 草 芽 孢 杆 菌 （Bacillus  subtilis ） KC‑20225， 已保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其 保藏编号是CGMCC  No.24848， 发酵周期为10 ‑20  h， 纳豆激酶产量为12500  IU/mL。 本工艺将废弃 物豆制品加工废水与柑橘深加工加工过程中产 生的废水综合利用， 提高生产效率， 促进经济发 展， 改善环境。 因此， 本发明具有广阔的市场前景 和工业价值。 权利要求书1页 说明书6页 CN 115011524 A 2022.09.06 CN 115011524 A 1.一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株， 所述菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis ) KC‑20225， 已于2022年5月 9日保藏于 中国普通微生物菌种保藏管 理中心， 保藏 号为CGMCC NO. 24848 。 2.权利要求1所述菌株在发酵生产纳豆 激酶中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 将枯草芽孢杆菌bs ‑20225活化， 在25～40 ℃下好氧发酵10～ 20 h； 其中， 好氧发酵培 养基为添加有无机盐的废水培 养基。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的废水为柑橘深加工过程中产生的废 水和豆制品加工废水。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述柑橘深加工过程中产生的废水和豆制 品加工废水按体积比 （20%~80%） ： （80%~20%） 混合。 6.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的无机盐为镁盐、 钾盐、 钙盐、 磷酸盐 中的任意 一种或几种的组合。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， 所述的无机盐含量 为1～10 g/L。 8.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 将枯草芽孢杆菌KC ‑20225活化后， 在37℃ 下好氧发酵12 h， 在发酵 过程中通气比0.8 v vm、 搅拌3 00 rpm; 其中， 所述的好氧发酵培养基为： K2HPO4•3H2O 1.2 g/L， KH2PO4 1.8 g/L， MgSO4•7H2O 0.56 g/L， CaCl2 0.34g/L， 豆制品加工废水和柑橘深加工过程中产生的废水替代水， 各占比 例为50%， pH=7.4。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 将发酵液中添加20%~30%的麦芽糊精和菊 粉进行喷干， 喷干条件为： 进风温度240~280℃、 出风温度80℃~140℃。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 纳豆激酶菌剂的活菌数≥1*109 CFU/g和 纳豆激酶的酶活≥25 000 IU/g。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011524 A 2一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物发酵技 术领域， 具体涉及一种制备纳豆 激酶菌剂的生产工艺。 背景技术 [0002]枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性需氧菌， 其能够迅速消耗动物体肠道内的游离 氧， 从而有效提高营养物质的利用效率。 枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、 多 粘菌素、 制霉菌素、 短杆菌肽等活性物质， 这些 活性物质对致病菌或内源性 感染的条件致病 菌有明显的抑制作用； 消 耗肠道中的游离氧， 造成肠道低氧， 促进有益厌氧菌生长， 间接抑 制其它致病菌生长菌体自身合成α ‑淀粉酶、 蛋白酶、 脂肪酶、 纤维素酶等酶类， 在消化道中 与动物体 （人体） 内的消化 酶类一同发挥作用； 能合 成维生素B1、 B2、 B6、 烟酸等多种B族维生 素， 提高动物体 （人体） 内干扰素和巨噬细胞的活性。 [0003]纳豆激酶是一种功能性物质， 具有防血栓作用、 安全性好、 易吸收、 药效持久等特 点， 与常规溶血栓药物相比较， 现行市场上使用的溶栓药物其溶栓作用主要并不是直接溶 解纤维蛋白， 而大部 分属于纤溶蛋白酶原激活剂 。 而纳豆激酶具有多种溶栓机制， 不仅表现 为纳豆激酶可直接降解纤维 蛋白为小肽或氨基酸， 同时， 纳豆激酶还 可以刺激血管内壁， 进 而产生内源纤维酶原激活剂， 通过 该激 活剂激活纤维蛋白酶， 从而达到增加溶栓效果的目的。 而且， 纳豆激酶还可以激活 由肾脏所产生的尿激酶原转变成尿激酶， 加大了溶栓效果。 另外， 纳豆激酶具有 溶解纤维酶 原激活剂抑制物的作用， 由此便可以维持体内纤维酶原激活剂的活性， 便于激活体内纤维 蛋白酶从而溶解纤维蛋白， 达到溶栓作用， 纳豆激酶在治疗血栓疾病 上具有广阔的研究及 应用前景。 因此， 纳豆激酶是一种新型溶栓药物。 目前， 纳豆激酶的发酵工艺一般 分为两种， 分别为固态发酵和液态发酵。 固态发酵与液态发酵相比， 更易出现易染菌、 味道难闻、 回收 率低、 纳豆激酶酶活较低、 操作难等问题。 液体发酵成本低、 污染少、 产酶量高、 易操作等优 势。 目前， 用于高产纳豆激酶工程菌有大肠杆菌、 乳酸菌及酵母菌等， 这些工程菌并不能直 接用于生产使用中， 而本发明中的菌株能够自身分泌并高产纳豆激酶， 同时， 使用豆制品生 产过程中的废水和柑橘深加工中的废水作为主要生产原料， 既利用了废弃物中的碳氮含 量， 又避免了液态发酵中副产物嘌呤物质等， 同时节约了成本， 改善 了环境污染。 [0004]因此， 本发明主要采用液态发酵的方式， 将粗原料——豆制品加工废水和柑橘深 加工过程中的废水作为发酵培养基， 极大程度上降低了生产成本， 一定程度上提高了纳豆 激酶的酶活， 同时对发酵 液添加一定保护剂， 采用喷雾 干燥工艺从而提高纳豆 激酶的酶活。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株， 通过ARTP 诱变 筛选高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌， 可以利用粗原料——豆制品加工废水与柑橘深加工废 水作为发酵基质， 既能改善环境， 又能提高经济效益。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下：说　明　书 1/6 页 3 CN 115011524 A 3