(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210816394.2 (22)申请日 2022.07.12 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430072 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 魏雪团　张岱源　 (74)专利代理 机构 合肥市博念易创专利代理事 务所(普通 合伙) 34262 专利代理师 张海峰 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A23L 3/3571(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一株解淀粉芽胞 杆菌HZ-12及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12及 其应用， 涉及微生物技术领域， 针对目前苹果防 霉物理方法由于价格昂贵不能普遍应用， 化学方 法中过度依赖传统杀菌剂导致化学物质残留、 环 境污染、 病原菌对杀菌剂抗性增加等一系列问 题， 不利于人体健康与生态环境的问题， 现提出 如下方案， 一株解淀粉芽 胞杆菌HZ ‑12， 菌体短杆 状， 革兰氏染色阳性， 芽胞近似圆形， 偏端生。 本 发明首次获得可在与金黄色葡萄球菌共培养中 抑制金黄色葡萄球菌的解淀粉芽胞杆菌， 该菌株 既高效拮抗有害真菌(禾谷镰刀菌、 黑曲霉、 绳状 篮状菌、 木霉、 产黄青霉、 聚多曲霉)又可高效降 解呕吐毒素， 该菌株在苹果中抗霉防腐方面具有 较高的应用价 值。 权利要求书2页 说明书5页 附图4页 CN 115109726 A 2022.09.27 CN 115109726 A 1.一株解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12， 其特征在于： 菌体短杆状， 革兰氏染色阳性， 芽胞近似圆 形， 偏端生。 在LB固体培养基上菌落圆形， 表 面粗糙， 边缘不齐， 菌苔表面无光泽， 不透明， 蔓 延。 最适生长温度3 0‑37℃， 适宜pH  6.8‑7.2。 2.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12及其应用， 其特征在于： 所述解淀 粉芽胞杆菌HZ ‑12菌株的16S  rRNA基因序列有1449个碱基， 该16S  rRNA基因序列如SEQ  ID  NO.1所示。 3.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12与金黄色葡萄球菌共培养中抑制 金黄色葡萄球菌的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 将解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12与金黄色葡萄球菌分别接种于LB液体培养基中， 于180rpm， 37 ℃培养12h左右， 分别得到解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12菌液与金黄 色葡萄球菌菌液。 将750 μL解淀 粉芽胞杆菌HZ ‑12菌液与1.5mL金黄色葡萄球菌菌液共同加入LB液体培养基中， 以只加入 1.5mL金黄色葡萄球菌的LB液体培养基作为对照， 在不同的时间点分别取样， 进 行稀释图平 板计数。 4.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12及其应用， 其特征在于： 所述解淀 粉芽胞杆菌HZ ‑12在拮抗有害真菌(禾谷镰刀菌、 黑曲霉、 绳状篮状菌、 木霉、 产黄青霉、 聚多 曲霉)又可高效降解呕吐毒素的方法， 包括以下步骤： 霉菌孢子悬浮液制备： 从4℃冰箱保藏的霉菌沙氏斜面上挑取菌落转接至装有50mL沙 氏固体培养基的100mL锥形瓶， 28℃恒温使其生长6 d后， 待表面长满菌落， 向锥形瓶中加入 无蒸馏水12 ‑15mL， 用无菌接种环在培养基与菌体生长表 面轻微刮取， 紧接着将含有菌丝和 孢子的液体一并倒入提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器， 缓慢推动并收集不含菌丝的滤 液， 将滤液收集至10mL无菌离心管中， 吸取约10 μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板， 生物显微 镜下计数观察调整至实验室所需的105CFU/mL的孢子浓度。 若浓度过大则 无菌水稀释至所 需浓度， 浓度过小可离心浓 缩； 牛津杯抑菌实验： 解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12单菌落接入LB种子液培养基中， 37℃、 180rpm 培养12h左右， 菌液浓度达到108CFU/mL。 将 10mL沙氏与100 μL霉菌孢子悬浮液(105CFU/mL) 混合加入直径为9mm的一次性培养皿作为第一层， 随后用灭菌后的镊子夹取无菌牛津杯放 置该层， 待再次倒入的沙氏凝固后移出牛津杯。 将108CFU/mL的100 μL解淀粉芽胞杆菌菌液 加入每个琼脂孔中， 于28℃， 培 养5d后观察抑菌圈大小； 呕吐毒素降解实验： 将解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12接种于LB液体培养基中， 于180rpm， 37℃ 培养12h左右， 得最适浓度在 108CFU/mL， 即得芽胞杆菌菌液。 称取8g麸皮和12g水， 121℃灭 菌后加入1.5mL芽胞杆菌菌液， 以加 入1.5mL的无菌蒸馏水作为空白对照， 于37℃培养48h。 测定芽胞杆菌降解呕吐毒素效果的方法采用上海臻科生物科技有限公司的呕吐毒素检测 试剂盒完成。 呕吐毒 素降解率根据如下公 式计算获得： 呕吐毒 素降解率＝ 100％×(空白‑样 品)/空白。 5.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽胞杆菌HZ ‑12及其应用， 其特征在于： 所述解淀 粉芽胞杆菌HZ‑12在苹果中抗霉防腐的方法， 包括以下步骤： a、 HZ‑12菌株接在LB培养基固体斜面上37℃培养； 刮取菌苔于LB液体培养基中37℃、 180rpm、 12h 培养； 吸取一定体积的菌液至甘油保藏管保存于 ‑80℃超低温冰箱中； b、 制备种子液：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115109726 A 2(1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培 养基平板上， 37℃培 养24‑36h， 使其活化； (2)将上述活化的种子转接到LB液体种子培养基中， 37℃， 180rpm培养14 ‑16h至生长中 期， 得最适浓度在108CFU/mL； c、 霉菌孢子悬 液制备： 从4℃冰箱保藏的霉菌沙氏斜面上挑取菌落转接至装有50mL沙氏固体培养基的100mL 锥形瓶， 28℃恒温使其生长6d后， 待表 面长满菌落， 向锥形瓶中加入 无菌蒸馏水12 ‑15mL， 用 无菌接种环在培养基与菌体生长表面轻微刮取， 紧接着将含有菌丝和孢子的液体一并倒入 提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器， 缓慢推动并收集不含菌丝的滤液， 将滤液收集至 10mL无菌离心管中， 吸取约10 μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板， 生物显微镜下计数观察调 整至实验室所需的105CFU/ mL的孢子浓度。 若浓度过大则无菌水稀释 至所需浓度， 浓度过小 可离心浓 缩； d、 苹果中抗霉防腐应用： 苹果经过蒸馏水清洗后使用浓度为0.1％的次氯酸钠浸润1min进行苹果消毒， 消毒后 用蒸馏水冲洗避免次氯酸钠残余， 晾干， 并将苹果 随机分组。 在大小、 外观一致的苹果表面 赤道处用无菌打孔器 打孔使伤口均匀(直径约5mm、 深度约17mm)， 在伤口部位注入30 μL不同 浓度的B.amyloliquefaciens  HZ‑12菌悬液(106CFU/mL、 107CFU/mL、 108CFU/mL、 109CFU/ mL)， 对照组注入30 μL无菌蒸馏水， 2h后， 同样的位置逐一注入2 ×104CFU/mL黑曲霉孢子悬 浮液， 在28℃下放置 5d后， 霉菌 侵染面积扩大， 即可观察到拮抗效果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115109726 A 3