(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210720534.6 (22)申请日 2022.06.23 (83)生物保 藏信息 CGMCC No. 24755 2022.04.22 (71)申请人 陕西科技大 学 地址 710021 陕西省西安市未央区大 学园 (72)发明人 鲁曦　李国花　周冰洋　 (74)专利代理 机构 北京中巡通大知识产权代理 有限公司 1 1703 专利代理师 李晓晓 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12Q 1/04(2006.01) A61K 35/747(2015.01) A61P 31/00(2006.01) A23L 33/135(2016.01) A23K 10/18(2016.01) C12R 1/225(2006.01) (54)发明名称 一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特 性的罗伊氏乳杆菌及其筛 选方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一株高产吲哚衍生物且具有 耐酸耐胆盐特性的罗 伊氏乳杆菌及其筛选方法 与应用， 属于微生物领域。 本发明利用MRS培养基 自健康人体 粪便样分离筛选出保藏编号为CGMCC   No.24755的菌株(L.reuteri  GH226‑12)， 先后经 形态学、 生理生化和16s  rRNA测序鉴定后， 对分 离得到的罗伊氏乳杆菌， 利用UPLC ‑Q‑Orbitrap   MS/MS技术对其吲哚衍生物产量进行检测筛选得 到。 该检测方法改善了复杂培养体系中吲哚衍生 物难以检测的困难， 具有线 性范围广、 灵敏度高、 样本需要量少和操作简便等优点。 最后对 L.reuteri  GH226‑12耐酸耐胆盐情况进行评价， 证实了高产吲哚衍生物的 罗伊氏 乳杆菌 (L.reuteriGH22 6‑12)能够耐受人体消化道的酸 碱环境， 可用于食品或药品的开发。 权利要求书2页 说明书9页 序列表1页 附图5页 CN 114990023 A 2022.09.02 CN 114990023 A 1.一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌， 其特征在于， 该高产 吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌的分类命名为罗伊氏乳杆菌 Lactobacillus  reuteri， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日 期为2022年4月22日， 保藏 号为CGMCC No.24755。 2.如权利要求1所述的一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌， 其特征在于， 所述罗伊氏乳杆菌能够高产的吲哚衍生物包括吲哚 ‑3‑乳酸、 吲哚 ‑3‑乙酸和 吲哚‑3‑丁酸。 3.权利要求1所述的一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌的筛 选方法， 其特征在于， 所述方法具体为： 采用MRS 培养基对样品进 行分离培养， 鉴定并筛选出 罗伊氏乳杆菌， 再通过UPLC ‑Q‑Orbitrap MS/MS方法筛选出高产吲哚衍生物的罗伊氏乳杆 菌， 进行耐酸耐胆盐能力测定， 筛选出高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐能力的罗伊氏乳 杆菌。 4.如权利要求3所述的一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌的 筛选方法， 其特征在于， 通过UPLC ‑Q‑Orbitrap  MS/MS方法筛选出高产吲哚衍生物的罗伊氏 乳杆菌的步骤为： 使用Hypersil  Gold C18反相色谱柱、 电喷雾离子源和Orbitrap质量分析 器测定筛选出的罗伊氏乳杆菌样品与吲哚衍生物标准品相同质荷比和保留时间的峰面积， 根据测定的标准曲线求得样品中吲哚衍生物的含量， 基于吲哚衍生物的含量筛选出高产吲 哚衍生物的罗伊氏乳杆菌 。 5.如权利要求3所述的一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌的 筛选方法， 其特征在于， 耐酸耐胆盐能力测定的步骤为： 挑取高产吲哚衍生物的罗伊氏乳杆 菌单菌落至MRS培养基中， 37℃厌氧培养24h； 以体积比1:100分别接种 至pH值＝3或pH值＝ 2， 以及胆盐浓度为0.3％或1％的MRS培养基中， 分别在0h， 2h和4h进行平板计数， 计算菌种 对不同pH和胆盐浓度的耐受情况； 同时挑取高产吲哚衍生物的罗伊氏乳杆菌单菌落到pH值 ＝6.5的MRS培养基做阴性对照， 其他条件相同； 最后， 计算相 对存活率， 筛选出高产吲哚衍 生物且具有耐酸耐胆盐能力的罗伊氏乳杆菌 。 6.如权利要求4所述的一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌的 筛选方法， 其特征在于， HypersilGold  C18反相色谱柱的规格为100mm ×2.1mm×1.7 μm， 流 动相A为0 ‑20mmol/L醋酸铵水， B为0 ‑20mmol/L醋酸铵和乙腈； 进样体积为1 ‑10μL， 流速为 30‑600 μL/min， 柱温为10 ‑40℃， 梯度洗脱程序如下： 7.如权利要求4所述的一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌的 筛选方法， 其特征在于， 电喷雾离子源和Orbitrap质量分析器采用正离子扫描模式， 数据依 赖性扫描FullMS ‑dd MS2， 喷雾电压2.5 ‑4.5kV； 电喷雾电离源的参数为： 鞘气体流量为20 ‑ 60arb； 辅助气体流量为 ‑10arb； 毛细管温度为200 ‑500℃； 全扫描和二级扫描分辨率分别为权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114990023 A 270 000和17 500； 质量采集范围为m/ z 100～1 500。 8.如权利要求4所述的一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌的 筛选方法， 其特征在于， 吲哚衍生物标准品的配制方法为： 用甲醇配制吲哚 ‑3‑乳酸、 吲哚 ‑ 3‑乙酸和吲哚 ‑3‑丁酸的1mg/mL混合标准品母液， 用改良M9培养基稀释成1000ng/mL、 500ng/mL、 10 0ng/mL、 20ng/mL和4 ng/mL工作液， 制成吲哚衍 生物标准品。 9.权利要求1所述的一株高产吲哚衍生物且具有耐酸耐胆盐特性的罗伊氏乳杆菌在食 品或药品中的应用。 10.如权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述食 品包括保健食 品， 保健食 品为发酵食 品或菌剂。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114990023 A 3