(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210680493.2 (22)申请日 2022.06.15 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.24960 2022.05.23 (71)申请人 齐鲁工业大学 地址 250300 山东省济南市长清区大 学路 3501号 (72)发明人 徐振上　王婷　刘新利　王家朋　 严梦远　朱珂莹　 (74)专利代理 机构 济南竹森知识产权代理事务 所(普通合伙) 37270 专利代理师 朱洪菊 (51)Int.Cl. C12N 13/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01)C12N 9/52(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一株高产溶葡萄球 菌酶的大肠杆菌突变 体 (57)摘要 本 发 明 提 供 了 一 种 大 肠 埃 希 氏 菌 (Escherichia  coil)BL21/(DE3)/pOpt ‑lys 4‑ 36， 保藏日期为2 022年5月2 3号， 保藏机构为中国 普通微生物菌种保藏管理中心， 地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号， 保藏编号CGMCC   No.24960， 本发明提供了大肠杆菌突变株， 所产 溶葡萄球菌酶为胞外分泌表达， 且突变株的胞外 溶葡萄球 菌酶活性较原 始菌株提高了 3.1倍。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115125235 A 2022.09.30 CN 115125235 A 1.一种大肠埃希氏菌(Escherichia  coil)BL21/(DE3)/pOpt ‑lys 4‑36， 保藏日期为 2022.5.23， 保藏机构为中国普通微生物菌种保藏管 理中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号， 保藏编号CGM CC No.24960。 2.权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichia  coil)BL21/(DE3)/pOpt ‑lys 4‑36的培 养方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 将大肠埃希氏菌(Escherichia  coil)BL21/(DE3)/pOpt ‑lys 4‑36接种于含有氨苄青 霉素的LB培养基中， 35 ‑37℃， 18‑200rpm培养获得大肠埃希氏菌(Escherichia  coil)BL21/ (DE3)/pOpt‑lys 4‑36。 3.如权利要求1所述培 养方法， 其特 征在于， 氨苄青 霉素的终浓度为10 0 μg/mL。 4.权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichia  coil)BL21/(DE3)/pOpt ‑lys 4‑36生产 溶葡萄球菌酶的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： ①将大肠埃希氏菌(Escherichia  coil)BL21/(DE3)/pOpt ‑lys 4‑36培养于含有氨苄 青霉素的LB培 养基， 35‑37℃摇床180 ‑200rpm培养11‑13h获得种子液； ②将种子液以体积分数2 ‑3％的比例转接至含有氨苄青霉素的LB培养基中， 培养到 OD600至0.6‑0.7； ③添加异丙基 ‑β‑D‑硫代半乳糖苷， 终浓度为0.45 ‑0.55mM， 并在180 ‑200rpm、 35 ‑37℃ 下诱导培养35‑37h， 获得 溶葡萄球菌酶发酵 液。 5.如权利要求4所述方法， 其特征在于， 步骤 ①、 步骤②中氨苄青霉素的终浓度为100μ g/mL。 6.一种筛 选胞外分泌溶葡萄球菌酶菌株的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： Ⅰ将待筛选菌株点接于下层添加异丙基 ‑β‑D‑硫代半乳糖苷、 氨苄青霉素抗性的LB平 板， 35‑37℃静置 培养11h以上， 制得含筛 选菌株的平板； Ⅱ将金黄色葡萄球菌过夜培养， 用磷酸盐缓冲液稀释至OD600为1.0的菌悬液， 将菌悬液 与LB固体培养基以体积比1： (95 ‑100)的比例混合， 作为含指示菌的上层培养基， 将含有指 示菌的上层培养基倒入步骤I制备的含筛选菌株的平板上， 制备上层平板， 在35 ‑37℃下孵 育22‑24h； Ⅲ通过步骤 Ⅱ平板上产生的抑菌圈筛 选胞外分泌溶葡萄球菌酶菌株。 7.如权利要求6所述方法， 其特 征在于， 步骤 Ⅰ中氨苄青 霉素的终浓度为10 0 μg/mL。 8.如权利 要求6所述方法， 其特征在于， 步骤 Ⅰ中异丙基 ‑β‑D‑硫代半乳糖苷的终浓度为 0.45‑0.55mM。 9.如权利要求6所述方法， 其特 征在于， 步骤 Ⅰ中培养12‑24h。 10.如权利要求6所述方法， 其特 征在于， 步骤 Ⅱ中磷酸盐缓冲液为10 0mM， pH7.0 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125235 A 2一株高产溶葡萄球菌酶的大肠杆菌 突变体 技术领域 [0001]本发明属于微生物产酶技术领域， 具体涉及一种高产溶葡萄球菌酶的大肠杆菌突 变体。 背景技术 [0002]溶葡萄球菌 酶(lysostaphin,Lys)可以专一性地作用于金黄色葡萄球菌细胞壁中 的Gly五肽交联桥， 从而裂解其细胞壁， 对金黄色葡萄球菌具有很好的溶菌杀菌效果。 尽管 溶葡萄球菌酶在预防和治疗葡萄球菌感染方面有非常大的应用潜力， 但由于其生产成本较 高， 目前仍没有被广泛的应用。 [0003]常压室温等离子体(Atmospheric  Room Temperature  Plasma， ARTP)诱变系统能 够在大气压下产生温度在25 ‑40℃之间的、 具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、 氧 原子、 氮原子、  OH自由基等)浓度的等离子体射流， 来改变目标生物细胞壁和质膜的结构和 通透性， 进而引起DNA损伤， 快速有效地突变细菌、 放线菌、 微藻、 真菌、 酵母等微生物。 ARTP 因其具有温度低， 活性粒子浓度高且种类多样、 对环境无污染和危害、 操作简易、 运行成本 低廉等优点， 已经成为发酵工业获得高产突变菌株的高效方法。 发明内容 [0004]针对现有技 术的不足， 本发明提供了一株高产溶葡萄球菌酶的大肠杆菌突变 体。 [0005]本发明结合ARTP诱变， 对 申请号为202210279685.2， 专利申请名称为一种利用大 肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法， 该专利文献中记载的大肠杆菌工程菌  BL21(DE3)/pET22b (+)‑Opt‑Lys进行诱变获得了一株胞外溶葡萄球菌酶产量高的突变菌株。 [0006]本发明也 提供了一种对诱变菌株进行高通 量的筛选的方法。 [0007]本发明的技 术方案如下： [0008]一种大肠埃希氏菌(E scherichia coil)BL21/(D E3)/pOpt ‑lys 4‑36， 保藏日期为 2022年5 月23号， 保藏机构中国普通微生物菌种保藏管理中心， 地址北京市朝 阳区北辰西 路1号院3  号， 保藏编号CGM CC No.24960。 [0009]上述大肠埃希氏菌(E scherichia coil)BL21/(D E3)/pOpt ‑lys 4‑36的培养方法， 包括如下步骤： [0010]将大肠埃希氏菌(Escherichia  coil)BL21/(DE3)/pOpt ‑lys 4‑36接种于含有氨 苄青霉素的  LB培养基中， 35 ‑37℃， 18‑200rpm培养获得大肠埃希氏菌(Esch erichia coil) BL21/(DE 3)/pOpt  ‑lys 4‑36。 [0011]根据本发明优选的， LB培养基的成分组成为： 蛋白胨10g/L、 酵母粉5g/L、 氯化钠 10g/L， 余 量水， pH值6.7。 [0012]根据本发明优选的， 氨苄青 霉素的终浓度为10 0 μg/mL。 [0013]上述大肠埃希氏菌(Escherichia  coil)BL21/(DE3)/pOpt ‑lys 4‑36生产溶葡萄 球菌酶的方法， 包括如下步骤：说　明　书 1/5 页 3 CN 115125235 A 3