(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210707652.3 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 山东和康源生物育种股份有限公司 地址 250101 山东省济南市高新区港兴三 路北段济南药谷研发平台1号楼B座 2101-212 2室 申请人 兰陵和康源生物育种有限公司 (72)发明人 许明清　汪建华　王胜　刘丹丹　 张中波　刘晓钰　 (74)专利代理 机构 北京科家知识产权代理事务 所(普通合伙) 11427 专利代理师 黄耀材 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01)C12N 1/02(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方 法 (57)摘要 本发明公开了一株鸡滑液囊支原体的培养 传代和保存方法， 包括改良Frey氏培养基的配 制， 滑液囊支原体的分离， 同时还包括滑液囊支 原体的传代和保存方法； 本检测方法优化了兽药 典的支原 体分离培养基的配方， 与成 品试剂相比 价格低廉， 分离率相当； 并对滑液囊支原体分离 的时机、 方法进行了规范； 同时对滑液囊支原体 的培养传代方法进行了优化， 对保存的方法进行 了摸索， 同时本方法操作简单， 节省了成本， 更规 范化。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 115216424 A 2022.10.21 CN 115216424 A 1.一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法， 其特征在于， 包括改良Frey氏培养基 的配制， 滑液囊支 原体的分离， 同时还 包括滑液囊支 原体的传代和保存方法； 所述改良Frey氏培 养基的配制包括如下步骤： （1） 准备如下原料： 氯化钠5.0g， 氯化钾  0.4g， 硫酸镁0.2g， 磷酸氢二钠1.6g， 磷酸二氢 钾0.2g， 葡萄糖10.0g， 进口水解乳蛋白 （BD） 5.0g， 酵母浸出粉5.0g， 以上成分按比例称重， 加入注射用水 逐一溶解； （2） 加入进口猪血清100.0ml， 1%辅酶I10.0ml， 1%L ‑半胱氨酸盐酸盐  10.0ml， 2%精氨酸 盐酸盐 20.0ml， 8万 IU/ml青霉素10.0ml， 1%酚红  1.0ml， 新制注射用水加至10 00ml； （3） 将以上成分按比例称重， 加入注射用水逐一溶解后， 用1mol/L氢氧化钠调整PH   7.6‑8.0， 用0.2 2um滤膜过 滤除菌， 定量分装， 放 4℃冷藏不超过7d， 否则需放 ‑20℃冻存； 所述滑液囊支 原体的分离包括如下步骤： （1） 挑取发生滑液囊支原体疾病的鸡， 取不同程度发病症状的鸡的病变关节， 喉头拭子 送检， 并将脏器取样后切勿冷冻， 以最快的速度低温送检实验室进行分离； （2） 将病鸡的关节部位， 清洗外部， 放置操作台进行无菌分离， 剪开病变部位， 用配制好 的改良Frey氏的培 养基对病变部位进行冲洗， 冲洗液 备用； （3） 取病变的筋腱、 粘液放置 到冲洗液中， 进行震动混匀， 放置冰箱浸内泡 一段时间； （4） 取病料液8000r/min离心， 5min， 取上清， 用0.22um的滤器进行过滤， 得到过滤液， 放 置到玻璃试 管中， 用1mo l/L氢氧化钠调节PH， 并置 于温箱培 养； 所述滑液囊支 原体的传代和保存方法包括如下步骤： 取分离到滑液囊支原体， 按照10%接种量接种到改良Fery氏培养基里， 置于37℃温箱培 养， 待培养基的PH值下降至 6.7‑7.0时收获； 得到菌株后将菌株进行纯化， 将培养颜色变黄的滑液囊支原体菌液涂布支原体 固体培 养基上， 倒置于培养箱内进行培养一段时间， 挑取固体培养基上 的单菌落至滑液囊支原体 液体培养基中进行培 养， 重复以上操作3次即得 纯化后的滑液囊支 原体， 继续传代。 2.如权利要求1所述的一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法， 其特征在于， 所述 滑液囊支原体的分离的步骤 （3） 中， 取病变的筋腱、 粘液放置到冲洗液中， 进 行震动混匀， 放 置4℃冰箱浸泡 4小时。 3.如权利要求1所述的一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法， 其特征在于， 所述 滑液囊支 原体的分离的步骤 （4） 中， 使培 养基PH在7.6 ‑8.0之间， 并置 于37℃温箱培 养。 4.如权利要求1所述的一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法， 其特征在于， 所述 滑液囊支原体的传代和保存方法的步骤 （2） 中， 将培养颜色变黄的滑液囊支原体菌液涂布 支原体固体培 养基上， 倒置 于5%CO2培养箱内37℃进行培 养5～7d。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115216424 A 2一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 禽病诊断检测和治疗的技术领域， 具体涉及 一株鸡滑液囊支原体的培 养传代和保存方法。 背景技术 [0002]目前支原体的分离在实践操作中非常的有难度， 一是支原体培养基的选择使用局 限， 虽然拥有成品试剂的厂家很多， 但是都不一定适用于所有类型的支原体分离， 其中有一 到两家培养基效果很好， 但是价格昂贵， 不适合日常检测批量分菌使用。 二是分离的时机很 重要， 需要找准分菌的节点进行分离 。 三是分离后培 养的方法， 操作有难度。 发明内容 [0003]本发明的目的在于提供一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法， 本检测方法 优化了兽药典的支原体 分离培养基的配方， 与成品试剂相比价格低廉， 分离率相当； 并对滑 液囊支原体分离的时机、 方法进行了规范； 同时对滑液囊支原体的培养传代方法进行了优 化， 对保存的方法进行了摸索， 同时本方法操作简单， 节省了成本， 更规范化。 [0004]为达到上述技术目的， 本发明采用了一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方 法， 包括改良Frey氏培养基的配制， 滑液囊支原体的分离， 同时还包括滑液囊支原体的传代 和保存方法； 所述改良Frey氏培 养基的配制包括如下步骤： （1） 准备如下原料： 氯化钠5.0g， 氯化钾  0.4g， 硫酸镁0.2g， 磷酸氢二钠1.6g， 磷酸 二氢钾0.2g， 葡萄糖10.0g， 进口水解乳蛋白 （BD） 5.0g  ， 酵母浸出粉5.0g， 以上成分按比例 称重， 加入注射用水 逐一溶解； （2） 加入进口猪血清100.0 ml， 1%辅酶I 10.0ml， 1%L‑半胱氨酸盐酸盐  10.0ml， 2%精 氨酸盐酸盐  20.0ml， 8万 IU/ml青霉素10.0ml， 1%酚红  1.0ml， 新制注射用水加至10 00ml； （3） 将以上成分按比例称重， 加入注射用水逐一溶解后， 用1mol/L氢氧化钠调整PH   7.6‑8.0， 用0.2 2um滤膜过 滤除菌， 定量分装， 放 4℃冷藏不超过7d， 否则需放 ‑20℃冻存； 所述滑液囊支 原体的分离包括如下步骤： （1） 挑取发生滑液囊支原体疾病的鸡， 取不同程度发病症状的鸡的病变关节， 喉头 拭子送检， 并将脏器取样后切勿冷冻， 以最快的速度低温送检实验室进行分离； （2） 将病鸡的关节部位， 清洗外部， 放置操作台进行无菌分离， 剪开病变部位， 用配 制好的改良Frey氏的培 养基对病变部位进行冲洗， 冲洗液 备用； （3） 取病变的筋腱、 粘液放置到冲洗液中， 进行震动混匀， 放置冰箱浸内泡一段时 间； （4） 取病料液8000r/min离心， 5min， 取上清， 用0.22um 的滤器进行过滤， 得到过滤 液， 放置到玻璃试 管中， 用1mo l/L氢氧化钠调节PH， 并置 于温箱培 养； 所述滑液囊支 原体的传代和保存方法包括如下步骤：说　明　书 1/3 页 3 CN 115216424 A 3