(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210603343.1 (22)申请日 2022.05.31 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114672446 A (43)申请公布日 2022.06.28 (73)专利权人 广东海洋大学 地址 524088 广东省湛江市麻章区海大路1 号 专利权人 碧沃丰生物科技(广东)股份有限 公司 (72)发明人 刘泓宇　王琦　谭北平　范德朋　 胡亚东　 (74)专利代理 机构 西安正华恒远知识产权代理 事务所(普通 合伙) 61271 专利代理师 陈选中(51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12N 11/12(2006.01) C12N 11/10(2006.01) C12N 11/04(2006.01) A23K 10/18(2016.01) A23K 50/80(2016.01) A23K 40/30(2016.01) C12R 1/145(2006.01) 审查员 陈永强 (54)发明名称 一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种丁酸梭菌制剂的制备方 法及应用， 其制备方法包括以下步骤： 将菌种活 化， 得到丁酸梭菌发酵液； 离心， 收集菌泥， 然后 加入保护剂溶液， 混匀， 再加入壁材溶液， 混匀， 最后冷冻干燥， 得到丁酸梭菌制剂； 其中， 保护剂 为脱脂乳、 β ‑环状糊精、 葡萄糖和磷酸氢二钾的 混合物， 壁材为明胶、 海藻酸钠或羧甲基纤维素 钠。 本发明通过保护剂和壁材的双重作用， 能够 有效的保证丁酸梭菌在凡纳滨对虾肠道中定植， 进而能够对凡纳滨对虾肠道健康的修复提供保 障。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 114672446 B 2022.08.12 CN 114672446 B 1.一种丁 酸梭菌制剂的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） 将菌种活化， 得到丁 酸梭菌发酵 液； （2） 将丁酸梭菌发酵液离心， 收集菌泥， 然后加入保护剂溶液， 混匀， 再加入壁材溶液， 混匀， 最后冷冻干燥， 得到丁 酸梭菌制剂； 其中， 保护剂为脱脂乳、 β ‑环状糊精、 葡萄糖和磷酸氢二钾的混合物， 保护剂溶液中脱 脂乳、 β‑环状糊精、 葡萄糖和磷酸氢二钾的浓度分别为50 ‑150g/L， 80 ‑120g/L， 20‑100g/L和 5‑15g/L， 溶剂为生理盐水； 壁材为明胶、 海藻酸钠或羧甲基纤维素钠， 壁材溶液中明胶、 海 藻酸钠或羧甲基纤维素钠的浓度均为10 ‑30g/L， 溶剂为 生理盐水； 步骤 （1） 中丁 酸梭菌发酵 液中活菌数量≥1 ×108CFU/mL； 步骤 （2） 中离心条件为： 温度3 ‑5℃， 转速 3000‑5000r/min， 时间10 ‑15min； 步骤 （2） 中丁 酸梭菌发酵 液和保护剂溶 液的体积比为8 ‑10： 1； 步骤 （2） 中壁材 溶液和保护剂溶 液的体积比为0.5 ‑1： 1。 2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中活化的具 体方法为： 将冻干菌种接种 于RCM液体培养基， 于35 ‑37℃条件下， 厌氧培养12 ‑16h， 得到种 子液， 将种子液重复接种和厌氧培养操作2 ‑3次， 然后将种子液接种于RCM液体培养基， 于 35‑37℃条件下， 厌氧培 养16‑24h， 得到丁 酸梭菌发酵 液。 3.一种丁酸梭菌制 剂， 其特征在于， 该制 剂是采用权利要求1 ‑2任一项所述的丁酸梭菌 制剂的制备 方法制得。 4.权利要求3所述的丁 酸梭菌制剂在制备益 生菌菌剂、 饲料或饲料 添加剂方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672446 B 2一种丁酸梭菌制剂的制备方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及 微生物制剂制备技术领域， 具体涉及 一种丁酸梭菌制剂的制备方法及 应用。 背景技术 [0002]丁酸梭菌是一种革兰氏阳性、 专性厌氧和内生孢子形成的细菌， 对低pH和高温环 境有很强的耐受性， 对多种抗生素表现出耐药性， 被认为是一种很好的饲料添加剂， 此外， 丁酸梭菌产生短链脂肪酸(SCFA)， 特别 是丁酸， 为肠上皮的再生和修复以及肠道健康微生 态环境的调节提供营养。 丁酸梭菌细胞壁中富含多种抗原物质(肽聚糖和磷壁酸)， 可诱导 机体发生免疫反应， 除了能够增强免疫反应外， 饲料中添加 丁酸梭菌还可提高动物的肠道 抗氧化性能。 丁酸梭菌作为益生菌， 在肠道中的定植能力影响着作用的发挥， 而定植能力的 强弱除了与菌体本身有关外， 还与制备工艺有关， 冷冻干燥法是常用的菌剂制备方法之一， 在真空冷冻干燥过程中， 由于处于低温缺氧状态， 菌体则会进入休眠状态， 可以保持其原有 特性， 然而， 在冷冻干燥过程中， 细胞经历 了不利的环 境条件， 对微生物产生损伤， 主要表现 为： 细胞膜的损伤： 干燥使得细胞膜 通透性增加， 对盐类敏感性增强； 机械损伤： 主要 是结冰 过程中冰晶对细胞膜的机械损伤； 溶质损伤： 在冰冻过程中细胞内水分溢出， 细胞膜渗透压 发生不可逆的改变。 因此， 需要在制备过程中加入冷冻保护剂， 现有技术中单一保护剂已不 能满足对微 生物的保护。 发明内容 [0003]为了解决上述技术问题， 本发明的目的是提供一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应 用， 以解决现有技 术中丁酸梭菌制剂定植效果差的问题。 [0004]本发明解决上述技术问题的技术方案如下： 提供一种丁酸梭菌制剂的制 备方法， 包括以下步骤： [0005]（1） 将菌种活化， 得到丁 酸梭菌发酵 液； [0006]（2） 将丁酸梭菌发酵液离心， 收集菌泥， 然后加入保护 剂溶液， 混匀， 再加入壁材溶 液， 混匀， 最后冷冻干燥， 得到丁 酸梭菌制剂； [0007]其中， 保护 剂为脱脂乳、 β ‑环状糊精、 葡萄糖和磷酸氢二钾的混合物， 壁材为明胶、 海藻酸钠或羧甲基纤维素钠。 [0008]本发明的有益效果为： 本发明通过保护剂和壁材的双重作用， 能够有效的保证丁 酸梭菌在凡纳滨 对虾肠道中定植。 [0009]脱脂乳作为一种大分子物质， 其中的乳清蛋白能够在菌体表面形成有效的保护 层， 并且为菌体提供多孔且轻的结构， 增强复水性； β ‑环状糊精是一种低聚糖， 在冷冻干燥 脱水的过程中起脱水保护剂的作用， 能够防止在冷冻干燥升华过程中物理脱 水对菌体的损 害； 葡萄糖中含有大量的自由羟基， 在冷冻 过程中。 对细胞膜原有的水分子基团进行替代， 进而与蛋白质和磷脂形成氢键， 确保了细胞膜的完整性； 磷酸氢二钾能够通过降低菌体中说　明　书 1/7 页 3 CN 114672446 B 3