(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210849580.6 (22)申请日 2022.07.19 (71)申请人 中国科学院生态 环境研究中心 地址 100085 北京市海淀区双清路18号 (72)发明人 胡立刚　高峻　陶少洋　何滨　 江桂斌　 (74)专利代理 机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 专利代理师 乔献丽　张莹 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 5/02(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种产甲烷菌 培养基及培养方法 (57)摘要 本发明提供产甲烷菌的培养基及培养方法， 所述培养基包括8g/L的甲酸钠和4g/L的乙酸钠。 通过增加或额外添加培养基中的甲酸钠和乙酸 钠至8g/L的甲酸钠和4g/L的乙酸钠， 并通入80％ 氮气+20％二氧化碳的混合气， 可在不使用氢气 的条件下培养产甲烷菌， 并使产甲烷菌快速大量 生长。 权利要求书1页 说明书10页 附图3页 CN 114958696 A 2022.08.30 CN 114958696 A 1.产甲烷菌的培 养基， 其特 征在于， 所述培 养基包括8g/L的 甲酸钠和4g/L的乙酸钠。 2.根据权利要求1所述的培养基， 其特征在于， 所述培养基还包括磷酸盐、 硫酸盐、 氯化 物、 微量金属元 素、 刃天青指示剂、 半胱氨酸、 硫化钠和维生素。 3.根据权利要求1或2所述的培养基， 其特征在于， 所述培养基还包括蛋白胨和酵母提 取物。 4.根据权利要求1 ‑3中任一项所述的培养基， 其特征在于， 所述微量金属元素包括： 铁、 锌、 锰、 钴、 铜、 镍、 钼、 钠、 钙、 铝、 钾中的一种或多种。 5.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的培养基， 其特征在于， 所述维生素包括： 维生素 B12、 对氨基苯甲酸、 生物素、 烟酸、 泛酸钙、 盐酸吡哆醇、 盐酸硫胺素、 叶酸、 核黄素、 硫辛酸 中的一种或多种。 6.产甲烷菌的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法包括在根据权利要求1 ‑5中任一项 所述的培养基中接种产甲烷菌， 并在所述培养基中通入80％氮气+20％二氧化碳的混合气， 对所述产甲烷菌进行培 养。 7.根据权利要求6所述的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法还包括监测产甲烷菌生 长情况， 若怀疑有污染风险， 则鉴定产甲烷菌种类。 8.根据权利要求1 ‑5中任一项所述的培 养基在培 养产甲烷菌中的应用。 9.制备甲烷的方法， 其特征在于， 所述方法包括利用根据权利要求1 ‑5中任一项所述的 培养基， 并在所述培养基中通入8 0％氮气+20％二氧化碳的混合气 培养产甲烷菌， 并收集所 述产甲烷菌产生的 甲烷。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述产甲烷菌为具有甲酸脱氢酶的氢营 养型产甲烷菌， 任选地， 所述产甲烷菌选自亨氏甲烷螺菌、 海沼甲烷球菌、 甲酸甲烷杆菌、 甲 烷叶菌和巴伐利亚甲烷粒菌 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958696 A 2一种产甲烷 菌培养基 及培养方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种产甲烷菌的培养基及培养方法， 尤其是具有甲酸脱氢酶(FDH)的 氢营养型产甲烷菌的培 养基及培 养方法， 尤其是在实验室培 养中。 背景技术 [0002]产甲烷菌是一种生存于绝对无氧环境中的古细菌。 产甲烷菌的培养要求绝对无氧 的还原性体系， 苛求二氧化碳、 甲醇、 甲酸、 乙酸等简单碳化合物实现能量代谢， 且通常只能 利用这些简单碳化合物实现能量代谢， 而不能使用常见的复杂碳源如葡萄糖、 丙酮酸钠、 乳 酸钠等， 极难在实验室中培 养。 [0003]甲烷产生是产甲烷菌生长的唯一能量代谢途径。 产甲烷菌主要有三种产甲烷途 径， 分别利用氢气+二氧化碳、 乙酸、 甲基化合物。 据此可将产甲烷菌分为氢营养型、 乙酸发 酵型、 甲基营养型。 根据产甲烷菌的代谢途径、 形态、 系统发育 关系等特征， 可将产甲烷菌 分 为6目、 13科、 3 3属。 [0004]一半以上的产甲烷菌为氢营养型(23属)， 即利用氢气作为电子供体、 二氧化碳作 为电子受体， 通过产甲烷菌特有的产甲烷途径实现能量代谢， 进而实现产甲烷菌的实验室 培养。 然而， 用这种方式培养产甲烷菌需要在培养容器中持续通入80％氢气和20％二氧化 碳混合气30 分钟以上以彻底 排除氧气， 每次制作培养基10 ×50mL泄漏的氢气量可高达200L 以上。 易燃易爆的高浓度氢气对实验室安全造成很大隐患， 也提高了产甲烷菌培养的实验 室基础设施门槛。 因此， 改良产 甲烷菌培养方式， 避免使用高浓度氢气作产 甲烷菌培养底 物， 是产甲烷菌实验室培 养的重大需求。 发明内容 [0005]75％(18属)的氢营养型产甲烷菌具有甲酸脱氢酶(Formate  dehydrogenase， FDH)， 可催化氢气、 二氧化碳与甲酸的相互转化。 因此理论上使用甲酸(或甲酸盐)代替氢 气、 二氧化 碳作为具有FDH的产甲烷菌 培养底物在原理上 是可行的。 [0006]尽管许多氢营养型产甲烷菌被证明可以利用甲酸产甲烷， 但除少 数产甲烷菌(如 Methanobacterium  formicicum)外， 大部分使用甲酸培养的产甲烷菌面临生长缓慢、 生物 量低等问题， 难以实现产甲烷菌的大量培养。 因此， 当前主流微生物保藏中心(美国ATCC、 德 国DSMZ)给出的氢营养型产甲烷菌培养基均使用80％H2+20％CO2培养(如DSM  medium 119、 DSM medium 141、 DSM medium 1523、 ATCC  medium 1405、 ATCC  medium2487等)。 而在最近使 用这些产甲烷菌纯培 养物进行 科学研究的论文中， 也均使用氢气培 养。 [0007]本发明提供一种不使用氢气的产甲烷菌的实验室培 养方法。 [0008]本发明提供如下技 术方案： [0009]一方面， 本 发明提供产甲烷菌的培养基， 其特征在于， 所述培养基包括8g/L的甲酸 钠和4g/L的乙酸钠。 [0010]在一些实施方案中， 所述产甲烷菌为具有甲酸脱氢酶的氢 营养型产甲烷菌 。说　明　书 1/10 页 3 CN 114958696 A 3