(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210766661.X (22)申请日 2022.06.30 (83)生物保 藏信息 CGMCC No. 1.12734 2020.07.20 (71)申请人 微康益生菌 （苏州） 股份有限公司 地址 215200 江苏省苏州市吴江经济技 术 开发区龙桥路10 33号 (72)发明人 方曙光　杨恒飞　程文　朱建国　 严涛　陈珂可　蒋大成　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 赵颖 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01)C12R 1/225(2006.01) (54)发明名称 一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制 备方法 (57)摘要 本发明提供一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌 冻干粉的制备方法。 所述制备方法包括以下步 骤： (1)种子培养： 将鼠李糖乳杆菌LRa05扩培三 代后， 再接种至含种子培养基的发酵罐中， 培养 至发酵液的OD600≥2.5， 得到种子液； (2)发酵培 养： 将步骤(1)得到的种子液移种至含发酵培养 基的发酵罐中， 进行培养， 长至对数生长期后期 降温， 且所述降温的过程中控制发酵液的pH为 5.8～6.0， 离心收集， 得到菌泥； (3)冻干： 将步骤 (2)得到的菌泥和复合保护剂混合， 进行乳化， 冷 冻干燥， 得到所述产细菌素的鼠李 糖乳杆菌冻干 粉。 使用本发 明所述制备方法得到的菌粉活菌数 提高、 菌粉储存稳定性提高、 菌粉分散溶解性加 强、 菌体抗菌活性增强。 权利要求书2页 说明书16页 CN 115261263 A 2022.11.01 CN 115261263 A 1.一种产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法包括 以下步骤： (1)种子培养： 将鼠李糖乳杆菌LRa05扩培三代后， 再接种至含种子培养基的发酵罐中， 培养至发酵液的OD600≥2.5， 得到种子液； 其中， 所述种子 培养基的氮源 包括酵母蛋白胨和酵母 浸粉； (2)发酵培养： 将步骤(1)得到的种子液移种至含发酵培养基的发酵罐中， 进行培养， 长 至对数生长期后 期降温， 且 所述降温的过程中控制发酵液的pH为5.8～6.0， 离心收集， 得到 菌泥； 其中， 所述发酵培 养基的氮源 包括酵母蛋白胨和酵母 浸粉； (3)冻干： 将步骤(2)得到的菌泥和复合保护剂混合， 进行乳化， 冷冻干燥， 得到所述产 细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉； 其中， 所述菌泥和复合保护剂的质量比为(0.8 ‑1.2):1， 所述复合保护剂按质量浓度计 包括： 海藻糖1 15～125g/L、 麦 芽糊精35～45g/L、 甘油25～3 5g/L和酵母细胞95～10 5g/L。 2.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述鼠李 糖乳杆菌LRa05为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus  rhamnosus LRa05菌株， 保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号， 保藏编号 为CGMCC No.1.12734， 保藏时间为2020年7月20日。 3.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述扩培三代的具体步骤为： 按接种量为1 ‑3％的体积百分含量将鼠李糖乳杆菌 LRa05接种于种子 培养基中， 扩培 至三代。 4.根据权利要求3所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 所述 扩培三代的具体参数为： 一代于5～15mL的试管中36～38℃培养9～11h； 二代于250～350mL 锥形瓶中3 6～38℃培 养9～11h； 三代于2.5～3.5L锥形瓶中3 6～38℃培 养5～7h。 5.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述种子培养基包括： 酵母蛋白胨8～12g/L、 酵母浸粉8～12g/L、 葡萄糖18～22g/L、 乙酸钠0.4～0.6g/L、 柠檬酸氢二铵1.8～2.2g/L、 K2HPO4·3H2O 1.8～2.2g/L、 MgSO4·7H2O  0.05～0.2g/L、 MnSO4 0.04～0.06g/L、 吐温 ‑80 0.8～1.2mL/L和半胱氨酸盐酸盐0.4～ 0.6g/L。 6.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述种子培养的具体步骤为： 将鼠李糖乳杆菌LRa05扩培三代后， 再按接种量为1 ‑ 3％的体积百分含量接种至含种子培养基的发酵罐中， 于36～38℃下培养4～6h， 培养至发 酵液的OD600≥2.5， 得到种子液。 7.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述发酵培养基包括： 酵母蛋白胨8 ‑12g/L、 酵母浸粉8 ‑12g/L、 葡萄糖38 ‑42g/L、 乙 酸钠0.4‑0.6g/L、 柠檬酸氢二铵1.8 ‑2.2g/L、 K2HPO4·3H2O 1.8‑2.2g/L、 MgSO4·7H2O 0.05‑ 0.2g/L、 MnSO4  0.04‑0.06g/L、 吐温 ‑80 0.8‑1.2mL/L、 半胱氨酸盐酸盐0.4 ‑0.6g/L。 8.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述培养的具体步骤为： 按接种量为1 ‑3％的体积百分含量将种子液移种至含发酵 培养基的发酵罐中， 于36～38℃培养10～12h后长至对数生长期后期后， 再以0.3～0.5℃/权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261263 A 2min的速率降温至25～28℃， 且 所述降温的过程中采用20 ‑30wt％的氢氧化钠水溶液调节发 酵液的pH为5.7～5.9。 9.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述离心收集的温度为25～28℃， 所述离心收集的转速为10000～14000rpm， 所述离 心收集的时间为15 0～180mi n。 10.根据权利要求1所述产细菌素的鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法， 其特征在于， 步 骤(3)中， 所述冷冻干燥的温度为 ‑45～‑25℃， 所述冷冻干燥的时间为3 6～40h。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261263 A 3