(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211039610.3 (22)申请日 2022.08.29 (71)申请人 新发药业有限公司 地址 257500 山东省东营市垦利开发区北 外环以南华丰路以东 （原垦利镇黄店 村东） (72)发明人 李希平　杨西建　王娟　刘婕　 张建华　刘洪海　夏国杰　孙锡友　 (74)专利代理 机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 专利代理师 孙振家 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 9/84(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基及 其应用 (57)摘要 本发明涉及一种产青霉素G酰基转移酶自诱 导培养基及其应用。 配方为： 蛋白胨5～2 0g/L、 酵 母粉5～20g/L、 硫酸铵2～8g/L、 磷酸氢二钠5～ 15g/L、 磷酸二氢钾2～6g/L、 硫酸镁0.5～2.5g/ L、 甘油6～20g/L、 葡萄糖2～5g/L、 乳糖0～10g/ L。 本发明还提供了利用该自诱导培养基发酵生 产青霉素G酰基转移酶的方法。 使用本发明提供 的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基诱导培养 含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的 大肠杆菌时， 乳糖的诱导能力相对较弱， 能够避 免前体蛋白在细胞质中的过度积累， 给翻译后修 饰过程以充足的时间， 从而减少包涵体的形成， 能够明显提高青霉素G酰基转移酶发酵酶活， 达 到52U/mL。 权利要求书1页 说明书5页 CN 115418331 A 2022.12.02 CN 115418331 A 1.一种产青霉素G酰基转移酶 自诱导培养基， 其特征在于， 所述培养基配方为： 蛋白胨5 ～20g/L、 酵母粉5～20 g/L、 硫酸铵2～8g/L、 磷酸氢二钠5～15 g/L、 磷酸二氢钾 2～6g/L、 硫 酸镁0.5～ 2.5g/L、 甘油6～ 20g/L、 葡萄糖2 ～5g/L、 乳糖0～10g/L。 2.如权利要求1所述的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基， 其特征在于， 配方为： 蛋白 胨10g/L、 酵母粉10g/L、 硫酸铵5g/L、 磷酸氢二钠10g/L， 磷酸二氢钾4g/L、 硫酸镁1.5g/L、 甘 油20g/L、 葡萄糖3g/L、 乳糖5g/L。 3.权利要求1或2所述的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基在发酵生产青霉素G酰基 转移酶中的应用。 4.一种利用权利要求1或2所述的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基发酵生产青霉素 G酰基转移酶的方法， 其特 征在于， 包括 步骤如下： (1)获取含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落， 置于甘油 中保存； (2)将含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落接种于LB液 体培养基中培养， 在35～40℃、 180～220rpm下培养2～8h， 获得种子液； 然后以8～12％的接 种量将种子液接种于产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基中， 在35～40℃、 180～220rpm下 诱导培养5～15h； 当溶解氧(DO)上升至65～75％时， 流加甘油和乳糖， 在27～37℃下， 继续 诱导培养10～20h， 得到含青 霉素G酰基转移酶的发酵 液。 5.如权利要求4所述的发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述种子液的接种量 为8～12％。 6.如权利要求4所述的发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述甘油流加速度为5～15 ml/L/h， 添加至产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基中甘油浓度 为400～600g/L。 7.如权利要求4所述的发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述乳糖流加速度为5～30 ml/L/h， 添加至产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基中乳糖浓度 为5～20g/L。 8.如权利要求4所述的发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 流加甘油和乳糖后诱 导培养温度为3 0℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115418331 A 2一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基 及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基及其应用， 属于生物发酵技 术领域。 背景技术 [0002]青霉素G酰基转移酶是半合成β ‑内酰胺类抗生素工业的重要酶， 主要用于促使D ‑ 对羟基苯甘 氨酸甲酯盐酸盐和6 ‑APA缩合成阿莫西林。 [0003]在基因工程菌中表达青霉素G酰基转移酶时， 一般选用强启动子T7的表达系统。 在 这类表达系统中， T7RNA聚合酶能特异识别T7启动子， 从而开启下游基因的大量转录， 有效 地启动目的蛋白青 霉素G酰基转移酶的表达 。 [0004]但是基于T7启动子的表达系统也有其不足之处。 青霉素G酰基转移酶的表达需要 用 IPTG诱导， 步骤比较繁琐。 而且一定浓度的IPTG会对细菌产生毒性， 直接影 响青霉素G酰 基转移酶的表达效率。 此外， 目前培养大肠杆菌一般使用LB培养基， 其组分之一是胰蛋白 胨， 由于胰蛋白胨是使用胰酶消 化酪蛋白后的产物， 而酪蛋白一般是从牛奶或大豆中提取 的， 因此， 胰蛋白胨中存在的微量乳糖成分会促进细菌产生 非目的性表达， 从而影响青霉素 G酰基转移酶表达量。 [0005]利用自诱导培养基培养细菌使之表达外源蛋白的方法解决了上述技术问题。 在培 养基中同时加入葡萄糖和乳糖， 大肠杆菌会优先利用葡萄糖， 在葡萄糖耗尽前不会诱 发lac 启动子； 当葡萄糖耗尽时， 乳糖发挥作用， 开启lac启动子诱导外源蛋白表达， 而乳糖的代谢 产物也同时作为细菌生长的碳源。 自诱导的方法省 去了监测培养基的菌密度和添加IPTG诱 导蛋白表达的步骤， 一方面使得实验操作更加简洁， 另一方面避免了IPTG对细菌的毒害作 用。 发明内容 [0006]针对现有技术的不足， 本发明提供了一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基及 其应用。 [0007]本发明的技 术方案如下： [0008]一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基， 所述培养基配方为： 蛋白胨5～20g/L、 酵母粉5～20g/L、 硫酸铵2～8g/L、 磷酸氢二钠5～15g/L、 磷酸二氢钾2～6g/L、 硫酸镁0.5～ 2.5g/L、 甘油6～ 20g/L、 葡萄糖2 ～5g/L、 乳糖0～10g/L。 [0009]根据本发明优选的， 所述培养基配方为： 蛋白胨10g/L、 酵母粉10g/L、 硫酸铵5g/L、 磷酸氢二钠10g/L， 磷酸 二氢钾4g/L、 硫酸镁1.5g/L、 甘油20g/L、 葡萄糖3g/L、 乳糖5g/L。 [0010]本发明还提供了上述自诱导培养基在发酵生产青霉素G酰基转移酶中的应用。 该 产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基用于对含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因 的大肠杆菌进 行培养和发酵生产青霉素G酰基转移酶， 生产的青霉素G酰基转移酶可以用于 合成阿莫西林。说　明　书 1/5 页 3 CN 115418331 A 3