(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210620245.9 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 西北民族大 学 地址 730010 甘肃省兰州市城关区西北新 村1号 (72)发明人 马忠仁　粟雨芯　苏君鸿　李方琳　 田晓静　乔自林　 (74)专利代理 机构 北京兴智翔达知识产权代理 有限公司 1 1768 专利代理师 张玉梅 (51)Int.Cl. C12N 1/38(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种体外刺激大肠杆菌生长的方法 (57)摘要 本发明涉及体外培养技术与肠道菌群技术 领域， 具体涉及一种体外刺激 大肠杆菌生长的方 法， 包括如下步骤： 获取氨苄青霉素抗性BL21和 氨苄青霉素抗性DH5α菌液； 获取无抗BL21和无 抗DH5α菌液： 牦牛奶制备： 分组培养； pH值的测 定。 其具有以下有益效果： 通过添加5mg/mL牦牛 奶促进大氨苄青霉素抗性BL21、 氨苄青霉素抗性 DH5α、 无抗BL21、 无抗DH5α在LB培养基中增殖； 通过添加5mg/mL牦牛奶使菌液的pH值降低。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 114874969 A 2022.08.09 CN 114874969 A 1.一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一、 获取氨苄青 霉素抗性BL21和氨苄青 霉素抗性DH5α 菌液； 步骤二、 获取 无抗BL21和无抗DH 5α 菌液： 步骤三、 牦牛奶制备： 步骤四、 分组培 养； 步骤五： pH值的测定 。 2.根据权利要求1所述的一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 其特征在于： 在步骤一 中， 所述氨苄青 霉素抗性BL21和氨苄青 霉素抗性DH5α 菌液的获取， 包括如下步骤： 步骤(1)、 分别取1 μL  pcDNA3.1(+)质粒转化至100 μL  E.coli DH5α 感受态细胞和100 μL   BL21感受态细胞， 冰上静置 30min， 42℃水浴3 0‑90s后冰上静置2 ‑5min； 步骤(2)、 在 步骤(1)得到的菌液 中加入900 μL  LB液体培养基， 于37℃下， 220r/min摇床 复苏1h； 步骤(3)、 取步骤(2)得到的100 ‑200 μL菌液涂布于含抗生素的LB固体培养基， 37℃恒温 箱倒置培养16h； 步骤(4)、 挑取步骤(3)得到的转化子接种于含4mL  LB培养基的试管中， 37℃、 220r/min 振荡培养12h， 得到氨苄青 霉素抗性BL21和氨苄青 霉素抗性DH5α 菌液。 3.根据权利要求2所述的一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 其特征在于： 所述含抗生 素的LB固体培 养基中的抗 生素仅用氨苄青 霉素， 与培 养基的添加比例均为1： 10 00。 4.根据权利要求1所述的一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 其特征在于： 在步骤二 中， 取100 μL  E.coli DH5α 感受态细胞和100 μL  BL21感受态细胞， 分别加入9 00 μL LB液体培 养基， 于37℃下， 2 20r/min摇床活化12h， 得到无抗BL21和无抗DH 5α 菌液。 5.根据权利要求1所述的一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 其特征在于： 在步骤三 中， 牦牛奶经冻干机冷冻成块， 称取奶粉 溶于纯水中， 配得25mg/mL浓度的奶液， 用0.22 μm滤 膜过滤后试验。 6.根据权利要求1所述的一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 其特征在于： 在步骤四 中， 分组为对照组、 5mg/mL组和0.5mg/mL组； 所述对照组在试 管中加入9.8mL  LB液体培 养基， 再接种20 0 μL活化好的新鲜菌液； 所述5mg/mL组在试管中添加7.8mL  LB液体培养基， 再添加2mL牦牛奶(25mg/mL)， 接种 200 μL活化好的新鲜菌液， 其中氨苄青霉素抗性BL21和氨苄青霉素抗性DH5α 两组使用含抗 生素的LB培 养基； 所述0.5mg/mL组在试管 中添加7.8mL  LB液体培养基， 再添加2mL牦牛奶(2.5mg/mL)， 接 种200 μL活化好的新鲜菌液， 其中氨苄青霉素抗性BL21和氨苄青霉素抗性DH5α 两组使用含 抗生素的LB培 养基； 分别在37℃， 2 20r/min下培养20h。 7.根据权利要求1所述的一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 其特征在于： 在步骤五 中， 每次测定前用无菌纯水清洗pH计探针， 直接插入培养液体中测量pH值， 每个样品测定三 次取平均值。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114874969 A 2一种体外刺激大肠杆菌生长的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及体外培养技术与肠道菌群技术领域， 具体涉及一种体外刺激大肠杆菌 生长的方法。 背景技术 [0002]牦牛奶营养丰富， 富含脂肪、 必需矿物质和健康的多不饱和脂肪酸， 如共轭亚油酸 和omega‑3脂肪酸。 [0003]现有技术中， 肠道微生物与疾病关系取得了重要研究进展， 人类肠道菌群与宿主 健康有密切联系， 大肠杆菌(Escherichia  coli， E.coli)是人和动物肠道中的常见菌群， 帮 助宿主消 化摄入的碳水化合物等食物， 其在肠道中丰度的高低会影响宿主的健康。 而大肠 杆菌BL21和DH5α 是实验室最常用的基因工程菌， 具有迅速繁殖、 生长， 大规模培养的特点。 因此， 用体外培养的技术方法可以研究牦牛奶对大肠杆菌的生长影响， 可为进一步研究牦 牛奶对人体肠道微 生态的影响提供 前期数据。 发明内容 [0004]本发明旨在 提供了一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 具体为通过牦牛奶在体外 培养中促进大肠杆菌菌株氨 苄青霉素抗性BL21、 氨苄青霉素抗性DH5α、 无抗BL21、 无抗DH5α 的生长， 同时降低菌液的pH值。 [0005]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案是： [0006]一种体外刺激大肠杆菌生长的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： [0007]步骤一、 获取氨苄青 霉素抗性BL21和氨苄青 霉素抗性DH5α 菌液； [0008]步骤二、 获取 无抗BL21和无抗DH 5α 菌液： [0009]步骤三、 牦牛奶制备： [0010]步骤四、 分组培 养； [0011]步骤五： pH值的测定 。 [0012]优选地， 在步骤一中， 所述氨苄青霉素抗性BL21和氨苄青霉素抗性DH5α菌液的获 取， 包括如下步骤： [0013]步骤(1)、 分别取1μL  pcDNA3.1(+)质粒转化至100 μL  E.coli DH5α 感受态细胞和 100 μL BL21感受态细胞， 冰上静置 30min， 42℃水浴3 0‑90s后冰上静置2 ‑5min； [0014]步骤(2)、 在步骤(1)得到的菌液中加入900 μL  LB液体培养基， 于37℃下， 220r/ min 摇床复苏1h； [0015]步骤(3)、 取步骤(2)得到的100 ‑200 μL菌液涂布于含抗生素的LB固体培养基， 37℃ 恒温箱倒置 培养16h； [0016]步骤(4)、 挑取步骤(3)得到的转化子接种于含4mL  LB培养基的试管中， 37℃、 220r/min振荡培养12h， 得到氨苄青 霉素抗性BL21和氨苄青 霉素抗性DH5α 菌液。 [0017]所述含抗生素的LB固体培养基中的抗生素仅用氨苄青霉素， 与培养基的添加比例说　明　书 1/3 页 3 CN 114874969 A 3