(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211144050.8 (22)申请日 2022.09.20 (71)申请人 加来 （济南） 生活科技有限公司 地址 250000 山东省济南市中国 （山 东） 自 由贸易试验区济南片区经十东路 28666号济南超算中心科技园2号楼4 层406-1室 (72)发明人 刘青　周娟　李雪　 (74)专利代理 机构 济南格源知识产权代理有限 公司 373 06 专利代理师 张蕾 (51)Int.Cl. A61K 8/99(2017.01) A61K 8/9789(2017.01) A61Q 19/02(2006.01)C12N 1/20(2006.01) (54)发明名称 一种具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵 原浆的制备方法及应用 (57)摘要 本发明属于微生物发酵技术领域， 尤其涉及 一种具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆 的制备方法及应用， 所述制备方法包括： 菌种活 化： 通过画线和摇菌， 进行菌种活化， 得到活化好 的菌种； 药材准备： 将四物汤药材当归、 川芎、 白 芍和熟地黄进行粉碎过筛， 得到药材半成品； 发 酵： 将活化好的菌种和药材半成品混合均匀， 进 行发酵培养， 得 发酵液， 将发酵液静置后过滤， 滤 液高温灭菌， 使菌种失活， 将灭菌后的发酵滤液 离心， 收集上清液， 即得到所述的具有美白功效 的中草药双歧杆菌发酵原浆。 本发 明利用双歧杆 菌对当归、 川芎、 白芍和熟地黄进行复合发酵， 产 出一种美白、 安全、 温和以及与肌肤亲和性好的 发酵液， 为美白产品的生物开发和推广应用提供 依据。 权利要求书2页 说明书10页 CN 115317435 A 2022.11.11 CN 115317435 A 1.一种具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： （1） 菌种活化： 通过画线和摇菌， 进行双歧杆菌 菌种活化， 得到活化 好的菌种； （2） 药材准备： 将四物汤药材当归、 川芎、 白芍和熟地黄进行粉碎过筛， 得到药材半成 品； （3） 发酵： 将步骤 （1） 得到的活化好的菌种和步骤 （2） 得到的药材半成品混合均匀， 进行 发酵培养， 得发酵液， 将发酵液静置后过滤， 滤液高温灭菌， 使菌种失活， 将灭菌后的发酵滤 液离心， 收集上清液， 即得到所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆。 2.根据权利要求1所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （1） 中， 所述菌种活化具体包括以下步骤： 配置双歧杆菌培养基， 分装至锥形瓶中， 其中一部分作为液体培养基， 另一部分加琼脂 粉配置成固体培 养基， 用高压蒸汽灭菌锅灭菌后放在室温下 备用； 将保藏的菌液取出解冻， 融化固体培养基， 将培养基均匀倒在灭过菌的培养皿中， 加入 抗生素， 待凝固后， 用接种环蘸取菌液， 在平板上进行划线， 放在37度培 养箱中过夜培 养； 24小时后， 用灭过菌的牙签挑取单菌落放置在双歧杆菌液体培养基中， 28 ‑35℃培养4 ‑ 12小时后， 选取较浓稠的一 瓶菌液备用。 3.根据权利要求2所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的制备方法， 其特 征在于， 所述双歧杆菌培养基包括以下重量份的组分： 蛋白胨10份、 肝浸粉5份、 牛肉浸粉3 份、 酵母浸粉5份、 胰酪蛋白胨8份、 可溶性淀粉0.5份、 氯化钠1份、 磷酸氢二钾1份、 磷酸二氢 钾1份、 葡萄糖10份、 7 水硫酸铁 0.01份、 硫酸锰0.0 05份、 半胱氨酸0.5份、 吐温80  1份。 4.根据权利要求2所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （3） 中， 所述发酵 具体包括以下步骤： 吸取步骤 （1） 所选取的较浓稠的菌液， 按1 ‑3%的比例接种至另一瓶双歧杆菌液体培养 基中， 28‑35℃培养4‑12小时后测OD值， 直至 达到0.4‑0.6时进行发酵； 将双歧杆菌菌液按1 ‑5%的比例接种， 药材按10%的比例混入， 28 ‑35℃培养36 ‑72小时 后， 得发酵 液； 将发酵液静置后过 滤， 滤液在120‑130°C的温度下高压灭菌15 ‑20min， 使菌种失活； 将灭菌后的发酵滤液在3000 ‑8000r/min离心20 ‑35min， 收集上清液， 即得到所述的具 有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆。 5.根据权利要求1所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （3） 所 得发酵原浆需要 进行抗氧化效果检测、 美白效果检测 和刺激性检测。 6.根据权利要求5所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的制备方法， 其特 征在于， 所述 抗氧化效果检测具体采用自由基清除实验， 实验方法为： 使用 10mL 试管设立样品管 （T） 、 样品本底 （T0） 、 DPPH  管 （C） 和溶剂本底 （C0） ， 每一样 品的每个受试浓度的样品管 （T） 需设立  3 支平行管， 同时  DPPH 管 （C） 也需设立  3 支平行 管； 在样品管 （T） 和样品本底 （T0） 中各加入  1mL 相同浓度的样品溶 液； 在所有试管中 （T、 T0、 C、 C0） 补充溶剂， 水溶性样品用水， 油溶性样品用  95%乙醇， 补足   3mL， 混匀；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115317435 A 2在样品管 （T） 和  DPPH 管 （C） 中加入  DPPH 乙醇溶液  1mL， 样品本底 （T0） 和溶剂本底 （C0） 用 95%乙醇代替， 轻 轻摇匀， 室温下静置  5 分钟； 将各支反应溶 液移入 1cm 比色皿中， 在  517nm 处测定吸光 值。 7.根据权利要求5所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的制备方法， 其特 征在于， 所述美白效果检测具体采用酪氨酸酶活性抑制实验， 实验方法为： 使用 10mL 试管设立样品管 （T） 、 样品本底 （T0） 、 酶反应管 （C） 和溶剂本底 （C0） ， 每一样 品的每个受试浓度的样品管 （T） 需设立  3 支平行管， 同时酶反应管 （C） 也需设立  3 支平行 管； 在样品管 （T） 和样品本底 （T0） 中各加入  1mL 相同浓度的样品溶液， 酶反应管 （C） 和溶 剂本底 （C 0） 则分别加入  1mL 磷酸氢二钠 ‑柠檬酸缓冲液； 在样品管 （T） 和酶反应管 （C） 中各加入  0.5mL 酪氨酸酶溶液， 样品本底 （T0） 与溶剂本 底 （C0） 以  0.5mL磷酸氢二钠 ‑柠檬酸缓冲液代替， 将样品和酪氨 酸酶充分混匀， 置37℃水浴 槽孵育10分钟； 依次在各管中加入2mL的左旋多巴溶液， 控制每管反应时间为5分钟， 即刻将各管反应 溶液移入比色皿中， 在475nm处测定吸光 值。 8.根据权利要求5所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的制备方法， 其特 征在于， 所述刺激性检测具体采用斑贴试验， 实验方法为： 选用面积为 40mm2、 深度约1m m的合格斑贴试纸； 试验处理： 将0.025mL发酵液滴入试纸 内， 将加有发酵液的试纸用无纺布贴敷于受试者 的前臂曲侧， 用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上， 持续24h； 每个测试均设置空白对照处 理， 在试纸内不 放置任何物质， 其 他过程同测试组 处理； 分别于去除试纸后3 0min、 24h和48h观察皮肤反应， 并记录观察结果。 9.权利要求1 ‑9任一所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的应用， 其特征 在于， 所述的发酵原浆作为美白功效成分添加到化妆品中。 10.根据权利要求9所述的具有美白功效的中草药双歧杆菌发酵原浆的应用， 其特征在 于， 所述化妆品包括 化妆水和面霜。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115317435 A 3