(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210969737.9 (22)申请日 2022.08.12 (71)申请人 昆明理工大 学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253号 (72)发明人 林连兵　周寰宇　蔡赛波　邓先余　 朱付千　张棋麟　王峰　郭军　 (74)专利代理 机构 昆明同聚专利代理有限公司 53214 专利代理师 苏芸芸 (51)Int.Cl. A23L 33/135(2016.01) A23L 29/00(2016.01) A23L 29/30(2016.01) A23P 10/30(2016.01)C12N 1/20(2006.01) C12N 11/10(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (54)发明名称 一种利用发酵罐气升法制备益生菌微胶囊 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用发酵罐气升法制备 益生菌微胶囊的方法， 该方法在培养结束后先通 过中空纤维柱切向流过滤技术对培养菌液进行 分离纯化， 可去除发酵罐中菌液的二价阳离子， 并可在短时间内完成菌液的分离纯化， 在制备微 胶囊过程中， 充分利用发酵罐稳定可控的搅拌系 统和精准的补料系统对微胶囊进行制备， 将壁材 溶液和菌 悬液混合形成凝胶作为水相， 之后将水 相乳化分散至油 相中， 加入交联剂将壁材固化成 型， 形成微小颗粒， 最后离心或过滤获得益生菌 微胶囊； 在发酵罐底部进行通气， 防止出现菌体 与凝胶的混合物沉底导致的结块现象， 该方法操 作简单， 成本低， 微胶囊粒径更均匀、 表面更光 滑、 包封率更高， 适 合大规模工业 化生产。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 115363216 A 2022.11.22 CN 115363216 A 1.一种利用发酵 罐气升法制备益 生菌微胶囊的方法， 其特 征在于， 步骤如下： （1） 将冷冻保藏的唾液乳杆菌在MRS固体培养基上划线活化后， 挑取单菌落置于MRS液 体培养基中37℃静置培养24h， 再按2 ‑5%接种量接种到装有MRS液体培养基的发酵罐中培 养， 培养结束后， 启动蠕动泵， 打开止流阀 Ⅰ和双向阀， 将发酵罐中的菌液输送到中空纤维柱 中进行过滤浓缩， 菌液过滤完成后， 立刻通过控制器启动补料蠕动泵将菌液体积2 ‑4倍的无 菌水泵入中空纤维柱中， 对过滤获得的益生菌进行洗涤， 洗涤完毕后， 关闭双向阀， 打开止 流阀Ⅱ， 再将菌液体积 0.2‑0.8倍的无菌水泵入中空纤维柱中， 通过止流阀 Ⅱ用灭菌后的容 器收集益生菌菌悬液； （2） 将去离子水、 保护剂、 海藻酸钠、 碳酸钙加入发酵罐中， 加热溶解灭菌后， 冷却至37 ℃， 然后将步骤 （1） 制得的有效活菌数为108‑1011cfu/mL的益生菌菌悬液， 通过控制器启动 补料蠕动泵泵入到发酵罐中， 混匀后制得水相， 其中保护剂由海藻糖、 蔗糖、 乳糖、 甘油组 成； （3） 在大豆油中加入司盘85， 混合均匀后灭菌冷却后制得油相， 其中司盘85在油相中的 体积百分比0.2 ‑0.4%； （4） 按水相与油相的体积比为1∶1 ‑3的比例， 通过控制器启动补料蠕动泵将油相加入发 酵罐的水相中， 并设置发酵罐中搅拌器转速为400 ‑600rpm， 通过控制器开启空气 压缩机， 空 气通过空气过滤器净化后以0.5 ‑2倍罐体体积/min的量通入发酵罐中， 搅拌反应5 ‑10min 后， 按冰醋酸溶液与油相的体积比为 1∶40‑60的比例， 通过控制器启动补料蠕动泵将体积浓 度8‑12%的冰醋酸溶液加 入发酵罐中， 固定化10 ‑20min， 停止搅拌， 再按沉降剂与水相体积 比为1∶8‑12的比例， 通过控制器启动补料蠕动泵向发酵罐中加入沉降剂0.2 ‑0.4mol/L的灭 菌氯化钙溶液， 微胶 囊形成并缓慢沉降， 最后采用补料蠕动泵依次吸走油相和水相后， 得到 粒径100‑400 μm的微胶囊； （5） 通过控制器启动补料蠕动泵将质量浓度0.4 ‑0.6%的壳聚糖溶液泵入发酵罐中与 微 胶囊混合， 在400 ‑600rpm下搅拌10min后从发酵罐底部出料口放出微胶囊悬液， 经过120目 筛网过滤后， 滤渣用水洗涤 2‑3次， 得到包埋湿微胶囊； （6） 按质量比1:2 ‑4的比例， 将湿微胶囊与硅藻土混合， 制得唾液乳杆菌微胶囊。 2.根据权利要求1所述的利用发酵罐气升法制备益生菌微胶囊的方法， 其特征在于： 海 藻糖与混合物的质量体积比为3 ‑5%， 蔗糖与混合物的质量体积比为5 ‑7%， 乳糖与混合物的 质量体积比为1 ‑3%， 甘油与混合物的质量体积比为2 ‑4%， 益生菌菌悬液与去离 子水等体积。 3.根据权利要求1所述的利用发酵罐气升法制备益生菌微胶囊的方法， 其特征在于： 海 藻酸钠在混合物中的质量体积浓度为1.5 ‑2%， 碳酸钙在混合物中的质量体积浓度为1.5 ‑ 2%。 4.根据权利要求1所述的利用发酵罐气升法制备益生菌微胶囊的方法， 其特征在于：   中空纤维柱的截留孔 孔径为0.01 ‑0.45µm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115363216 A 2一种利用发酵罐气升法制备 益生菌微胶囊的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种利用发酵罐气升法制备益生菌微胶囊的方法， 属于生物技术领 域。 背景技术 [0002]益生菌， 是一类 活的微生物， 摄入足量的益生菌能够促进肠道健康， 保持宿主肠道 菌菌群平衡， 从而起到改善宿 主健康的作用。 简单来说， 益生菌是一种 广泛存在于动物肠道 中， 并能起到抑制有害细菌、 促进肠道运动、 提高肠道机能等作用的一系列 活菌。 首先发现 益生菌益生功能的是俄国科学家Mctchnikoff， 他发现益生菌能够在肠道内增殖， 抑制有害 菌的生长， 从而调节肠道内微生态平衡， 促进人体健康。 益生菌发挥益生作用需要两个条 件： 有足够的益生菌能够通过胃液到达肠道； 有足够的益生菌定植于肠道中。 但益生菌菌体 直接通过胃液并定植于肠道是非常困难的。 因为益生菌在低pH值、 高胆盐等环境下容易失 活。 而益生菌制剂后确保了高存活率， 长保质期及耐胃酸、 胆盐和消化酶。 针对这些要求， 益 生菌微胶囊技 术逐渐进入国内外研究者们的视野。 [0003]微胶囊技术一般是指通过化学法、 物理法， 以天然或合成高分子可成膜的聚合物 为囊壁， 将气体、 液体、 固体等微小物质进 行包埋及固化， 并在一定条件 下起到缓释的作用。 益生菌微胶 囊的常用制备方法有： 挤压法、 乳化法等； 乳化法是通过乳化作用将菌体与凝胶 的混合溶液分散， 从而 快速制备益生菌微胶 囊， 该方法具有能够高效产出直径较小的颗粒、 操作简单、 设备要求低、 适合大规模工业化生产等优点。 此外作为包埋壁材的藻酸盐因具有 保护作用强， 操作简便、 无毒性、 价格低廉、 生物相容性高和易加工等优点成为了应用于微 胶囊固定化 技术中最为广泛的聚合物。 [0004]传统乳化法制备出的微胶囊， 因液体培养基和益生菌代谢产生的二价阳离子会与 海藻酸钠的Na+发生离子 交换反应， 从而堆积提前形成交联网络结构， 而影响后期的包埋 效 果， 因此需要提前对益生菌液进行分离纯化， 传统上利用离心机对菌液进行分离纯化去除 上清液， 但因为离心机的限制， 处理的菌液量有限， 且离心时间长， 高速旋转下对于益生菌 活性也有损伤， 往往只能进行小批量的微胶囊制备， 且耗时长， 无法大规模工业上的应用。 不仅如此， 传统乳化法制备出 的微胶囊， 制备过程中易染菌， 导致菌体容易失活； 制备好湿 胶囊后， 为了提高微胶 囊的保质时间、 增加稳定性和降低运输成本， 通常使用喷雾干燥与冷 冻干燥降低微胶囊的含水量， 而喷雾干燥对实验环境要求较严格； 冷冻干燥产率低， 耗能 高， 也大大限制了微胶囊在工业上 大规模的应用。 发明内容 [0005]针对现有技术存在的问题， 本发明提供一种利用发酵罐气升法制备益生菌微胶囊 的方法， 该方法利用普通生物发酵罐实现了益生菌微胶囊的工业化制备， 本发明首次采用 中空纤维柱切向流系统对发酵液中的菌体进行分离纯化， 在短时间内分离纯化大量菌液， 并且降低对益生菌活性的损伤； 然后通过蠕动泵将纯化后的益生菌泵到发酵罐中进行微胶说　明　书 1/6 页 3 CN 115363216 A 3