(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210863463.5 (22)申请日 2022.07.22 (71)申请人 青岛康小鹿生物科技有限公司 地址 266100 山东省青岛市崂山区海尔路 63号1号楼6 05户 (72)发明人 彭健　孟像海　胡晓珂　王鹏　 闵军　方素云　张海坤　 (74)专利代理 机构 济南泉城专利商标事务所 37218 专利代理师 张贵宾 (51)Int.Cl. C12P 7/42(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种利用微 生物转化花色苷的方法 (57)摘要 本发明属于生物工程技术领域， 更具体地， 涉及一种利用微生物转化花色苷的方法。 本发明 利用蓝莓为原料提取花色苷并利用大肠杆菌将 其转化为可直接被利用的酚酸物质， 即将价值低 的大分子高聚体转化为活性高、 生物利用率高的 小分子活性物质， 提高了花色苷有效利用率。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 115181759 A 2022.10.14 CN 115181759 A 1.一种利用微 生物转化花色苷的方法， 其特 征在于： 步骤如下： S1、 蓝莓前处理： 取无损伤无腐烂的新鲜的蓝莓， 进行多次清洗， 清洗完成后进行保鲜 操作， 冷冻保藏 一段时间后， 利用破壁机粉碎后过筛处 理得到蓝莓的果渣； S2、 花色苷的粗提物的制备； 利用丙酮： 水： 柠檬酸： 作为萃取剂， 将300g的蓝莓果渣放 入到2L的萃取剂中进行研磨， 进行低温萃取， 温度为40 ‑45℃， 时间为60min； 得到的浆液进 行超声处理， 处理时间30分钟， 超声次数为3次， 控制温度为30℃， 每次的超声间隔为10分 钟， 将超声处理后的悬浮液进 行离心处理， 得到的沉淀物依次进 行抽滤、 旋转蒸发操作得到 粗提物， 将上述 粗提物溶于体积比为1:1的乙醇和水的混合溶 液中； S3、 花色苷的提纯： 将步骤2制备的花色苷的粗提物利用柱色谱进行分离， 利用丙酮进 行梯度洗脱， 每次洗脱用1L的丙酮， 洗脱两次， 得到花色苷洗脱液， 所述花色苷洗脱液在40 ℃下进行旋转蒸发， 得到 干燥的花色苷提取物； S4、 使用 MRS 培养基活化和扩培大肠杆菌； 并将大肠杆菌的活化菌液接种至MRS液体 培养基， 在37℃下培养48小时， 每4小时进 行一次摇匀； 培养完成后， 转移微生物培养液至无 菌离心管中， 离心后 倒去上清液， 得沉淀， 用蒸馏水洗涤1次， 得到微 生物菌体； S5、 将步骤S3花色苷提取物5g加入到10ml纯净水中， 用0.23um微孔滤膜过滤除菌， 将得 到过滤除菌的花色苷提取物中加入 磷酸钾缓冲液中； S6、 将步骤S4的微生物菌体25g加入到步骤 （5） 中的花色苷提取物的缓冲液中， 将上述 溶液置于35～37℃静置发酵； S7、 发酵结束后， 在步骤S6中的菌悬液中加入细胞通透剂， 10分钟后， 对菌悬液进行超 声处理30 分钟， 促进菌体破裂释放内容物， 然后离心10 分钟， 分离菌体， 得到的上清液， 然后 分别利用2倍体积的正己烷萃取和2倍体积的乙酸乙酯萃取， 获得转 化产物。 2.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法， 其特征在于： 所述步骤S1的具 体操作如下： 取无损伤无腐烂的新鲜的蓝莓， 进行多次清洗， 清洗完成后晾干水分， 然后将 蓝莓放入26 ‑30℃进行热保存半小时， 然后将热 处理后的蓝莓放入到 冷冻室内， 采用降温速 率为0.5℃/h逐步降温 的方式， 降温到5 ‑7℃时， 停止降温； 保持在3 ‑4℃， 冷藏10小时， 将冷 藏后的蓝莓放置到保鲜液中， 浸泡时间为  3‑5min， 完成浸泡后将蓝莓取出后晾干； 将晾干 的蓝莓放入保鲜箱内， 再将保鲜箱 放入到冷冻室进行冷藏， 初始时， 冷冻室的温度为 1‑2℃， 存贮0.5 h后， 再使冷冻室的温度降为 ‑2‑5℃， 存贮2h后， 利用破壁机粉碎后过筛处理得到 蓝莓的果渣。 3.根据权利要求2所述的利用微生物转化花色苷的方法， 其特征在于： 所述保鲜液按照 重量份数包括以下组分： 葡萄籽35份、 壳聚糖25份、 蒸馏水500份， 制备方法为： 将葡萄籽放 入容器内， 加入上述份数的蒸馏水进行煎煮， 加热后并保持沸腾10min， 然后冷却到室温后 过滤后得到过 滤液， 再向过 滤液内添加上述份数的壳聚糖即得到保鲜液。 4.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法， 其特征在于： 所述步骤S2中的 丙酮、 水、 柠檬酸的体积比为70： 25： 5 。 5.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法， 其特征在于： 所述步骤S5 中磷 酸钾缓冲液的浓度为7.0 ‑7.5g/L。 6.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法， 其特征在于： 所述步骤S7中所 述细胞通透剂为吐温 ‑60， 所述吐温 ‑60的加入量 为6.5‑10.5g/L。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115181759 A 27.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法， 其特征在于： 大肠杆菌的活化 菌液接种至 MRS液体培 养基的接种量 为1.5%。 8.根据权利要求1所述的利用微 生物转化花色苷的方法， 其特 征在于： 所述步骤S4中的使用MRS  培养基活化和扩培大肠杆菌的操作如 下： 将大肠杆菌的菌粉 溶于无菌水， 稀释一定倍数后接种于  MRS 固体培养基， 封口， 在37℃下培养  48 h， 挑选形 态良好的单菌落进行平板划线， 传代培 养三代， 全程无菌操作， 避免污染。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115181759 A 3