(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210841210.8 (22)申请日 2022.07.18 (71)申请人 浙江省农业科 学院 地址 311500 浙江省杭州市石桥路198号 (72)发明人 汪雯　肖兴宁　肖英平　杨华　 王文思　吕文涛　马灵燕　马洁乐　 (74)专利代理 机构 北京中济纬天专利代理有限 公司 11429 专利代理师 张姗 (51)Int.Cl. C12N 1/36(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门 氏菌进入 VBNC态的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用次氯酸钠诱导肠炎 沙门氏菌进入VBNC态的方法， 本发明涉及生物技 术领域， 包括配制培养基， 培养基设置为BHI培养 基， 并在培养基冷却至室温后， 对培养基进行紫 外灭菌15min， 在无菌的环境下将试验菌株在BHI 中保持37℃孵育24h， 采用离心 的方式对细菌细 胞进行收集， 用0.85％(w/v)无菌生理盐水洗涤 3 次， 然后重悬于0.85％(w/v)无菌生理盐水， 得到 109CFU/mL的菌悬液， 对次氯酸钠胁迫处理， 对 VBNC态细胞计数， 本发明通过次氯酸钠对细菌进 入VBNC状态进行诱导， 避免了常规的依靠低温、 高温、 寡营养、 低pH、 光照、 氧化压力、 双氧水等来 实现， 同时采用染料的计数方式， 更加的方便快 捷， 同时观察效果明显 。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 115232779 A 2022.10.25 CN 115232779 A 1.一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其特征在于： 包括以下步 骤： 步骤一： 菌株选取 选取肠炎 沙门氏菌S.Enteritidis  CVCC 1806， 其保存在－80℃以下， 传代为1 ‑5次； 步骤二： 配制培养基， 培养基设置为BHI培养基， 并在培养基冷却至室温后， 对培养基进 行紫外灭菌15mi n； 步骤三： 菌悬 液制备 用0.85％(w/v)无菌生理盐水洗涤3次， 采用离心的方式对细菌细胞进行收集， 然后重 悬于0.85％(w/v)无菌生理盐水， 得到109CFU/mL的菌悬 液； 步骤四： 次氯酸钠胁迫处 理 用已灭菌的无菌水将含56.8mg/mL氯的NaClO原液消毒剂原液稀释至100mg/L备用， 取 菌悬液(109CFU/mL)和100mg/L  NaClO溶液各0.5ml于 无菌EP管中， 使 其涡旋混匀， 最终体系 中胁迫浓度为5 0mg/L； 步骤五： VBNC态细胞计数 对可培养细胞计数， 通过平板计数法来测定步骤四中50mg/LNaClO胁迫处理不同时间 后体系中可培 养细菌的数量； 对活细胞计数， 将菌悬液浓度调整至107 ‑108CFU/mL， 采用商业化的Live和Dead   BacLight检测试剂盒(Molecu lar Probes,Carl sbad,CA,USA)对活、 死和损伤 状态的细菌进 行区分。 2.根据权利要求1所述的一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其 特征在于： 步骤三中， 离心时， 保持环境温度为 4℃， 离心速率 为10000rpm， 并持续5mi n。 3.根据权利要求1所述的一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其 特征在于： 步骤四中， 其中对混合均匀的试剂放置在室温环境中， 并分别对胁迫处理0.5h、 1h、 1.5h、 2h、 2.5 h和3h进行记录， 并加入10 0 μL 1.5％Na2S2O3终止反应。 4.根据权利要求1所述的一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其 特征在于： 步骤五 中对可培养细胞计数还包括采用0.85％(w/v)无菌生理盐水连续稀释1mL 消毒样品， 并将适当稀释液接种在PCA 平板上， 然后在37℃下培 养24h。 5.根据权利要求1所述的一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其 特征在于： 步骤五中还 包括以下步骤： S5.2.1对染料进行配制； S5.2.2制备对照试剂； S5.2.3对细菌样品检测； S5.2.4进行 FCM测试。 6.根据权利要求5所述的一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其 特征在于： 染料制备包括SYTO9染料和碘 化丙啶(PI)染料， 对其进行1:1体积混合。 7.根据权利要求5所述的一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其 特征在于： 对照试剂包括阴性对照试剂和阳性对照试剂， 所述阴性试剂为每1mL消毒处理过 的菌液加 入3 μL混合染料， 取90℃加热15min的菌液1mL加入3 μLPI染料混合， 所述阳性试剂 为未经消毒剂处 理菌液1mL加入3 μL  SYTO9染料混合。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115232779 A 28.根据权利要求5所述的一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其 特征在于： 所述细菌样品检测包括将混合物置于室温黑暗中孵育15分钟， 将孵育结束的样 本经流式管过滤， 使用BD  Biosciences FACS Verse流式细胞仪(BD  Bioscience， USA)检测 细菌样品。 9.根据权利要求5所述的一种利用次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌进入VBNC态 的方法， 其 特征在于： 所述FCM测试为使用配备488nm和640nm激光的BD ‑AccuriC6流式细胞仪进行FCM 测试。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115232779 A 3