(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210803346.X (22)申请日 2022.07.07 (71)申请人 珠海麦得发生物科技股份有限公司 地址 519000 广东省珠海市横琴新区粤澳 合作中医药科技产业园豆蔻路36号2 栋103室 (72)发明人 田道贺　沈宏伟　张恒文　孙磊　 叶秀生　吕金艳　 (74)专利代理 机构 常州市权航专利代理有限公 司 32280 专利代理师 王淑敏 (51)Int.Cl. C12P 7/625(2022.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种利用盐单胞菌生产PHA的方法 (57)摘要 本发明涉及微生物发酵技术领域， 尤其涉及 一种利用盐单胞菌生产PHA的方法。 利用微生物 连续发酵得到PHA的方法， 容易被杂菌污染， 难以 保证纯种培养。 针对上述问题， 本发明提供一种 利用盐单胞菌生产PHA的方法， 发酵所用微生物 为嗜盐单胞菌， 这种菌能适应高盐浓度的培养 基， 正是这种高盐环境避免了培养基被空气中的 杂菌污染， 确保了嗜盐单胞菌的纯种培养。 另外， 本发明这种三段式微生物连续发酵技术可使嗜 盐单胞菌体的增殖过程主要发生在发酵罐1中， 菌体增殖向PHA合成转变的过程主要发生在发酵 罐2中， PHA快速合成积累的过程主要发生在发酵 罐3中， 整个发酵过程可持续进行三个月， 延长了 单次发酵的时间， 产能得到大 大提高。 权利要求书3页 说明书9页 附图1页 CN 115125275 A 2022.09.30 CN 115125275 A 1.一种利用盐单 胞菌生产PHA的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)将三份等体积的菌液分别置于发酵罐1、 发酵罐2、 发酵罐3中， 三个发酵罐之间依次 有管道连接并通过蠕动泵驱动菌液流动； (2)当发酵罐1中的葡萄糖浓度低于10g/L时， 开始向发酵罐1中补加料一， 同时将发酵 罐1中的菌液以及料二加入到发酵罐2中； 与此同时， 将发酵罐2中的菌液以及料三加入到发 酵罐3中， 同时收集发酵罐3中泵出的菌液； 全程监控发酵罐1中的OD600值， 当发酵罐1中菌 液的OD600值低于50时， 停止发酵； 整个发酵过程是个连续的过程， 发酵罐1、 2、 3中的菌液体积均不发生变化， 一直保持动 态平衡； 发酵罐1、 2、 3中的搅拌速度均为75 0‑800rpm； 发酵罐1、 2、 3中菌液的温度均为3 6.5℃； 发酵罐1、 2、 3中菌液的pH＝8.5 ±0.1。 2.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法， 其特征在于， 所述发酵罐 1、 2、 3大小尺寸完全相同。 3.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法， 其特征在于， 所述菌液由 营养液和盐单胞菌培养液按照体积比10:1组成， 所述营养液由营养物质与水组成， 所述营 养物质在水中的浓度如下： 葡萄糖60g/L 玉米浆干粉12g/L 尿素2g/L 氯化钠40 ‑60g/L 硫酸镁0.2g/L 柠檬酸铁铵0.0 5g/L 无水氯化钙0.015g/L 七水硫酸锌0.1mg/L 四水硫酸锰0.0 3mg/L 硼酸0.3mg/L 五水硫酸铜0.01mg/L 钼酸钠0.0 3mg/L； 所述盐单 胞菌培养液按照以下步骤制备： (1)制备LB6 0液体培养基 将适量的酵母浸粉、 胰蛋白胨、 氯化钠溶解在水中得到培养液， 并采用浓度为3M的氢氧 化钠水溶液调节培养液的pH＝8.0 ±0.3， 所述酵母浸粉在水中的浓度为5g/L， 所述胰蛋白 胨在水中的浓度为10g/L， 所述氯化钠 在水中的浓度为6 0g/L； (2)制备LB6 0固体培养基 将适量的酵母浸粉、 胰蛋白胨、 氯化钠搅拌混合均匀， 采用浓度为3M的氢氧化钠水溶液 调节培养液的pH＝8.0 ±0.3， 并加入适量琼脂粉， 搅拌均匀后于121℃下高温高压灭菌 20min得到LB60固体培养基， 所述酵母浸粉在水中的浓度为5g/L， 所述胰蛋白胨在水中的浓 度为10g/L， 所述 琼脂粉在水中的浓度为16g/L， 所述氯化钠 在水中的浓度为6 0g/L；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115125275 A 2(3)制备种子液 步骤a， 取保存于 ‑80℃的盐单胞菌甘油管， 划线接种至LB60固体培养基上， 36.5℃下培 养24h； 步骤b， 从步骤a的LB60固体培养基上挑取盐单胞菌重新划线接种至LB60固体培养基 上， 36.5℃下培 养24h； 步骤c， 从上一步骤b的LB60固体培养基上挑取盐单胞菌接种至盛有30mL  LB60液体培 养基的25 0mL三角瓶中， 3 6.5℃下、 2 20rpm/mi n震荡培养10h， 即得到种子液； (4)取3mL步骤(3)得到的种子液， 按照1％接种体积比接种至300mL  LB60液体培养基 中， 36.5℃下、 2 20rpm/mi n震荡培养10‑12h， 即获得盐单 胞菌培养液。 4.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法， 其特征在于， 所述料一由 营养物质与水组成， 所述营养物质在水中的浓度如下： 5.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法， 其特征在于， 所述料二由 葡萄糖基液与微量元素母液按照体积比10:1组成， 所述葡萄糖基液由营养物质与水组成， 所述营养物质在水中的浓度如下： 葡萄糖500‑520g/L 尿素7.55g/L； 氯化钠40 ‑60g/L 所述微量元素母液由微 量元素与水组成， 所述 微量元素在水中的浓度如下： 氯化钼0.218g/L 氯化铁9.7g/L 氯化钙7.8g/L权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115125275 A 3