(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210709666.9 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 珠海麦得发生物科技股份有限公司 地址 519060 广东省珠海市横琴新区粤澳 合作中医药科技产业园豆蔻路36号2 栋103室 (72)发明人 田道贺　沈宏伟　张恒文　孙磊　 叶秀生　吕金艳　 (74)专利代理 机构 广州市诺 丰知识产权代理事 务所(普通 合伙) 44714 专利代理师 黄国亮 (51)Int.Cl. C12P 7/625(2022.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用盐单胞菌重复批次 发酵生产PHA的方法， 相较于以往的单批次发酵， 本发明方法将发酵完成的菌液按照一定体积比 例留在发酵罐中， 通过与LB培养基混合培养， 重 新形成大量种子液， 再次进行发酵。 该方法减少 了单批次种子液扩繁的步骤， 直接利用上一批次 的菌液作为种子液扩大培养， 降低种子液制备成 本； 同时减少了发酵罐的清洗、 消毒过程， 提高发 酵罐的利用率， 产能增 加0.5～1.5倍。 权利要求书1页 说明书4页 CN 115044624 A 2022.09.13 CN 115044624 A 1.一种利用盐单 胞菌重复批次发酵生产PHA的方法， 包括： S1)以发酵基础培 养基作为培 养物， 接种盐单 胞菌液； S2)补料培养： 当菌液中的含糖量降至10g/L后， 依次补充补 料A、 补料B和补料C， 控制糖 浓度在5～15g/L； 补料C补充完继续培养至菌液的残糖量降至不 高于1g/L， 放出部分菌液， 从放出的部分 菌液中提取PHA； S3)在剩余的菌液中加入发酵基础培 养基， 重复S2)进行重复批次发酵； 其中： 发酵基础培养基的组分主要为： 葡萄糖340～560g/L， 酵母粉2～5g/L， 尿素30～50g/L， 玉米浆干粉3 0～40g/L； 补料A的组分主 要为： 葡萄糖  500～800g/L， 尿素27.72 ～44.35g/L； 补料B的组分主 要为： 葡萄糖  500～800g/L， 硫酸铵5～8g/L； 补料C的组分主 要为： 葡萄糖80 0g/L。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的 体积比为5： 95 至10： 90。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S4)中， 剩余的菌液与发酵基础培养基 的体积比为5： 95 至10： 90。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S2)中， 菌液中的含糖量降至10～ 15g/ L时， 进行补料操作。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S2)中， 补料操作时控制菌液中的含糖 量为8～15g/L。 6.根据权利要求1～5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述发酵基础培养基还添加微 量元素， 具体为硫酸镁0.2  g/L， 柠檬酸铁铵0.05  g/L, 无水氯化钙0.015  g/L， 七水硫酸锌 0.1mg/L， 四水硫酸锰0.03mg/L， 硼酸0.3mg/L， 六水氯化钴0.2mg/L， 五水硫酸铜0.01mg/L， 氯化镍六 水合物0.02mg/L， 钼酸钠0.0 3mg/L。 7.根据权利要求1～5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述补料A的体积是步骤S1)中 发酵体积的8～15%。 8.根据权利要求1～5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述补料B的体积是步骤S1)中 发酵体积的6～10%。 9.根据权利要求1～5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述补料C的体积是步骤S1)中 发酵体积的10～15%。 10.根据权利要求1～5任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤S2)中， 放出部分菌液占菌 液总体积的70～ 90%。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044624 A 2一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物工程领域， 具体涉及一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的 方法。 背景技术 [0002]聚羟基脂肪酸酯 （PHA） 是一种胞内聚酯， 它具有类似于合成塑料的物化特性及合 成塑料所不具备 的生物可降解性、 生物相容性、 光学活性、 压电性、 气体相隔性等许多优秀 性能。 聚羟基脂肪酸酯在可生物降解的包装材料、 组织工程材料、 缓释材料、 电学材料以及 医疗材料方面有广阔的应用前 景。 [0003]现有PHA的生产以微生物发酵为主， 传统的PHA发酵工艺已经比较成熟， 经改良后 的盐单胞菌发酵48h的PHA积累 量可达70％以上， 然而PHA生产过程产生废水的处理问题却 难以彻底解决， 这已成为限制P HA发酵生产发展的瓶颈问题。 P HA的发酵时间也相对较长， 整 体的发酵效率较低， 这 导致PHA的生产成本居高不下， 制约了PHA的应用范围。 [0004]盐单胞菌是常用的PHA发酵菌株， CN111349662A、 CN111500650A、 CN111394398A、 CN113801810A等公开了不同使用盐单胞菌生产PHA的工艺。 这些生产工艺在一定程度上提 高了PHA的产量， 但是依然分批发酵， 单次发酵的时间一般长达48 h， 批次间隔一般为2 4h， 每 次发酵都需要重新 准备种子液， 生产成本依然较高。 [0005]开发出一种高效的PHA发酵工艺， 具有非常重要的意 义。 发明内容 [0006]本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足， 提供一种利用盐单胞菌重复批 次发酵生产PHA的方法。 [0007]本发明所采取的技 术方案是： 一种利用盐单 胞菌重复批次发酵生产PHA的方法， 包括： S1)以发酵基础培 养基作为培 养物， 接种盐单 胞菌液； S2)补料培养： 当菌液中的含糖量降至 10g/L后， 依次补充补料A、 补料B和补料C， 控 制糖浓度在5～15g/L； 补料C补充完 继续培养至菌液的残糖量降至不高于 1g/L， 放出部分菌液， 从放出的 部分菌液中提取PHA； S3)在剩余的菌液中加入发酵基础培 养基， 重复S2)进行重复批次发酵； 其中： 发酵基础培养基的组分主要为： 葡萄糖340～560g/L， 酵母粉2～5g/L， 尿素30～ 50g/L， 玉米浆干粉3 0～40g/L； 补料A的组分主 要为： 葡萄糖  500～800g/L， 尿素27.72 ～44.35g/L； 补料B的组分主 要为： 葡萄糖  500～800g/L， 硫酸铵5～8g/L； 补料C的组分主 要为： 葡萄糖80 0g/L。 [0008]在一些方法的实例中， 盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的体积比为5： 95至说　明　书 1/4 页 3 CN 115044624 A 3